Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
При рассмотрении будем использовать те же обозначения, что и в конкурентной схеме. Кроме того, обозначим константы скоростей образования и диссоциации комплексов антител с определяемым и меченым антигеном соответственно k\ и ki* (M_I-c_1); fe_i и k*-\ (с-1); Т — время инкубации с меченым антигеном. В рамках принятой модели первая стадия анализа проходит по схеме
Обозначим через п долю центров, связывания антител, заполненных после установления равновесия с антигеном, т. е. я[Ат]0= =[АтАг]=[Ат]о—[Ат] или п= 1—[Ат]/[Ат]о. Выразив в уравнении (9.19) [АтАг] через ([Ат]0 и представив равновесную концентрацию свободных центров связывания антител и антигена как разность начальной концентрации и концентрации комплекса, получим
к
Ат + Аг-.—- АтАг; ЛГ[Ат] [Аг] = [АтАг].
(9.19)
1Аг]0 = л1Ат]0 + г-5-.-1
1 — « Л
(9.20)
238
Возможность определения данной начальной концентрации ан-тйгена в методе последовательного насыщения зависит от степени, насыщения антител. Если при взаимодействии с антигеном заполняется очень малая часть центров связывания, то после добавления меченого антигена регистрируемый сигнал в пределах ошибки изменения не будет отличаться от сигнала в отсутствие
определяемого антигена. Учитывая* точность, характерную для проведения анализа, можно приближенно принять, что достоверное определение концентрации антигена будет осуществляться как минимум при 10%-ном заполнении центров связывания (п= =0,1) и максимум при 90%-ном заполнении (п=0,У). Характерная кривая титрования приведена на рис. 39. Соответствующие этим степеням заполнения начальные концентрации антигена [Аг]„и„ и [Аг]макс, по существу, являются минимально и максимально определяемыми для данного метода, причем [Аг]Мин фактически отражает нижний предел обнаружения антигена.
Подставляя численные значе-чения п в выражение (9.20) и округляя, получаем:
1Аг]мин^=;0,1 ^[Ат]04~—j ;
[Аг]макс [Ат]0 -j—— .
Л.
Рис. 39. Характерная кривая титрования, получаемая в результате проведения первой стадии ИФА по методу последовательного насыщения:
по оси абсцисс — концентрация определяемого антигена; по оси ординат — концентрация свободных центров связывания антител; Агт1п и Агтах — концентрации определяемого антигена, при которых степень. заполнения антител антигеном (я) составляет 10 и 90% соответственно
(9.21)
(9.22)
Выражение (9.21) иллюстрирует логически понятное положение о необходимости использования для детекции низких концентраций антигена высокоаффинных антител. Из этого же выражения следует, что для снижения абсолютного значения [Аг]мпн (т. е. для повышения чувствительности) необходимо снижать концентрацию l^Tjo до примерно равной обратной константе связывания 1//С-Дальнейшее снижение [Ат]0 нецелесообразно, так как в пределе может привести только к двукратному уменьшению [Аг]МИн, что в большинстве случаев непринципиально. В то же время возможность уменьшения [Ат]0 лимитируется чувствительностью детекции метки, концентрация которой в комплексе с антителами, очевидно,
239
не может превышать [Ат]о. С уменьшением [Ат]0 будет также возрастать и время достижения равновесия на первой стадии.
На практике часто возникает необходимость измерения концентраций антигена, значительно превышающих значение 1/К-В этом случае целесообразно проводить первую стадию в кинетическом режиме, что существенно снижает и длительность анализа в целом, или же прибегать к разведениям исследуемых образцов.
Сравнивая (9.21) и (9.22), нетрудно заметить, что при изменении [Ат]0 значительно меняется ширина рабочего диапазона. Если при малых концентрациях (,[Ат]0<С1//С) она составляет два порядка (0,1/КЧ-10//(), то при больших — только один (0,1 [Ат]0-г-[Ат]0). В ряде случаев (в зависимости от изменения содержания антигена в биологической жидкости) увеличение рабочего диапазона определяемых концентраций может быть целесообразным. Но следует учитывать, что это приводит к некоторому увеличению относительной погрешности вычисления концентрации антигена за счет уменьшения крутизны калибровочной кривой.
Качественно рассмотрев некоторые закономерности анализа на первой стадии, перейдем к анализу ситуации, возникающей после удаления несвязавшихся компонентов и добавления в систему меченого антигена. При этом в рамках принятой модели идут два процесса: связывание меченого антигена свободными активными центрами антител и диссоциация образовавшегося на первой стадии специфического комплекса по следующей схеме:
k
Ki
Ат-j-Аг*^-^-^-АтАг* (9.23)
АтАт«-——Ат + Аг (9.24)
Схема описывается системой уравнений:
d 1АтАг.]_^ kx [Ат] [ Аг] - k-г [АтАг] (9.25) dt
-^^-=л![Ат][Аг*]-Л*_1[АтАг*1 (9.26) dt
[Ат]0=[АтАг*]-[-[АтАг]-}-[Ат] (9.27)
ТУ=[Аг] + [АтАг] (9.28)
[Ar*]0=[Ar*]-f [АтАг*] (9.29)
с начальными условиями; [АтАг*]=0; [АтАг]=Л^, где N — молярная концентрация антигена, оставшегося в комплексе с антителами после удаления несвязавшихся компонентов.
Возможности аналитической системы на второй стадии в основном определяются временем инкубации и концентрацией меченого
240
актигена. Как и для первой стадии, проведем качественную оценку влияния этих параметров.
