Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Регистрируемой величиной в иммуноферментном анализе является концентрация продукта ферментативной реакции. Скорость его образования пропорциональна каталитической активности в системе и определяется по изменению какого-либо ее параметра
233
(оптическая плотность, интенсивность люминесценции или флуоресценции и т. д.).
Проводя анализ конкурентным методом по рассмотренной схеме, определяют снижение равновесной концентрации связанного с антителами меченого антигена при наличии в системе определяемого соединения по отношению к этому же параметру в отсутствие антигена. В условиях пропорциональности концентраций продукта реакции и фермента регистрируемые физические параметры от фоновой и «рабочей» равновесных концентраций Ат * также будут отличаться. Пределом обнаружения определяемого антигена [Аг] О мин в данном случае будет та его концентрация, при которой различие между регистрируемыми сигналами при [Аг]0мин и при [Аг]0=0 превышает ошибку измерения прибора. При данной каталитической активности фермента возрастание абсолютного значения измеряемого параметра можно достичь путем увеличения времени проведения ферментативной реакции.
# Применение высокоактивных фрементов или подбор условий, приводящих к увеличению эффективного значения &кат, позволяет уменьшать начальную концентрацию меченого антигена при сохранении абсолютного значения регистрируемого прибором параметра. Это делает анализ более экономичным, а при высоких значениях констант связывания, как отмечалось выше, приводит к увеличению чувствительности определения.
Влияние константы связывания меченого антигена на положение калибровочного графика. При рассмотрении теоретических основ радиоиммунологического анализа, как правило, предполагается равенство констант связывания с антителами нативного и меченного изотопом антигена. В ИФА это предположение может соблюдаться в отдельных случаях, но его нельзя считать общим. Сохранение иммунологической активности антигена, связанного с ферментом, в значительной степени зависит от соотношения их размеров и расположения антигенных детерминант на поверхно-
Рис. 36. Теоретические калибровочные зависимости в конкурентном анализе при различных соотношениях констант связывания для меченого и определяемого антигенов:
[Ат1о=12,5 нМ; 1Лг*]о — 0,4 нМ; для кривых
1, 2, 3 К* = 108 м-1; /С= Ют, Ю9, Ю8 М-'; для 4 108 м-1; К* = 109 м-1
234
cfp молекулы. Поэтому представляет интерес проанализировать случай конкуренции за активные центры антител молекул антигена, обладающих различными константами связывания.
На рис. 36 приведены теоретические калибровочные графики, построенные при различных соотношениях констант связывания нативного и меченого антигенов К и К*. Из сравнения зависимостей следует, что при неизменных концентрациях реагентов наклон на- [Лт-Аг},нМ чального участка кривых возрастает при увеличении отношения К/К*, ' т. е. из нескольких .перекрестно реагирующих антигенов с наилучшей чувствительностью будет определяться тот, у которого константа 0,1 связывания в максимальное число раз превосходит константу связывания меченого антигена.
Анализ связывания антигена при гетерогенности активных центров ' антител. Неоднородность по константам связывания присуща большинству популяций антител. В общем случае процесс связывания осу- _____
ществляется множеством центров, $ Ю [Аг]0)нМ
обладающих различным сродством
К антигену, что крайне осложняет Рис. 37. Теоретические калибровоч-
математическое описание модели. ™%7„1Г1зкоГфТГь” i»*
Однако даже при значительном раз- тел:
ЛИЧИИ констант связывания ИММО- кривая /— [Ат]0=0,3 иМ;
билизованные антитела эксперимен- =109 м-1; кРивая 2 —к высокоаффин-
tt 1 иым антителам «добавлены» низкоаф-
тально Трудно дифференцировать фииные с /С=/С* = Ю7 М-1 н коицент-более чем на два типа центров. По- рацией 2,7 нм; [Ar*]0=i им для обоих
к графиков
этому практический интерес пред- 5 ставляет анализ модели с двумя
типами центров, характеризующимися различными эффективными значениями констант связывания антигена.
При различии констант связывания меченого и определяемого антигенов с активными центрами антител данная система в равновесии описывается следующими уравнениями:
[Ат^ + А'! [Атг] [Аг] -(-/С*[ATl] [Ar*l=[ATlIo (9.15)
[At2] + К2 [Ат2] [Аг] +К1 [Ат2] [Аг*] = [Ат2]0 (9.16)
1Аг] +*?, [Atj] [Аг]+/С21Ат2] 1Аг]=[Аг]0 (9.17)
[Аг] + К\ [ATl] [Аг*]+К\ [Ат»] [Аг*1=[Аг*]0 (9.18)
235
[Дг>-Аг*]-<М
О,/4т, Аг Аг]-10в,М
где Ки Ki* и К2, Кг*— константы связывания определяемого и меченого антигенов с активными центрами антител Ат] и Ат2 соответственно.
Анализ данной модели позволяет оценивать влияние добавки в систему низкоаффинной фракции антител на результаты определения антигена (рис. 37). Из решения системы уравнений (9.15—9.18) на ЭВМ следует, что вклад низкоаффинных антител в основном проявляется в сдвиге калибровочного графика вверх по оси ординат и увеличению фонового сигнала.
Время проведения анализа по конкурентной схеме определяется, в основном, временем приближения реакции антиген — антитело к равновесному состоянию. Это время, в свою очередь, зависит от констант скоростей реакции образования и диссоциации комплекса антиген — антитело, а также от начальных концентраций компонентов. Так как Рис. 38. Теоретические кинетиче- значения констант скоростей /Ci и ские кривые изменения концентра- /С—i обусловлены природой реаги-Ции компонентов при конкурентном рующих веществ, диапазон концен-анализе. трации определяемого антигена —
