Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Вычислив из (9.7) значение [Аг], подставив его в (9.6) и заменив [Аг*]0—[Аг*] на [АтАг*], получим в неявном виде зависимость концентрации связанного с антителами меченого антигена от начальной концентрации определяемого антигена:
В соответствии со схемой анализа максимальная концентрация комплекса [АтАг*] (а следовательно, и максимальный регистрируемый сигнал) образуется в отсутствие определяемого антигена
Таким образом, за нижний предел обнаружения антигена следует принимать его концентрацию, способную вызывать достоверно регистрируемое изменение сигнала (рис. 30), где В* — концен-
[Аг]0=[Аг 1 4
1 -f /С[Аг] +К*[Аг*} ’
К [Ат]0,[Аг]
(9.6)
[Аг*1о=[Аг*] 4
К* [Ат]р [Аг*]
(9.7)
1 + К [Аг] 4- К* [Аг*] ’
1Аг]о
К* [Ат]0 [Аг*]0
I К* [Ат]0
К
[АтАг*] К
(9.8)
([Аг]0=0).
228
трация комплекса |АтАг*] в отсутствие определяемого антигена; S* — фактор, характеризующий относительную ошибку определения величины В*, [Аг]омин — минимально детектируемая концентрация антигена или предел обнаружения.
Если калибровочная кривая имеет гиперболический вид, как на рис. 31, то начальный участок кривой при малых значениях [Аг]о' можно считать линейным. Для установления предела обнаружения необходимо проанализировать на этом участке произ-д [АтАг*1 водную- —J-
д [Аг]0
[Аг10ми, = 5*В*-^АгтдА;*1
д [Аг]0
:?*В*
[Аг]„
при [Ат]о-0 [Аг*]
(9.9)
САг*] —[Аг*]о—в* 4 '
С учетом выражения (10.8) получаем
[Аг]0мин = 5*В*( 1—^ + --!--1_
1 J I к ^ К* ([Аг]0 — В*)2 ^
+_gL[A?3o [Alb- -!—\ , (9.10)
* К (В*)2 J V • I
При отсутствии определяемого антигена ([Аг]о=0) из уравнения (9.3) следует:
[Дг.)_ [Arb-lA.j = [А.Ь-1А,]р_ = _в._
>С» IАт] К* [Ат]р К* [A.]f 1 ’
где [Ат]р=[Ат]о—В* — концентрация свободных центров связывания антител при достижении равновесия в отсутствие определяемого антигена.
Подставляя из (9.11) значение [Аг*] в уравнение (9.4), получаем
|Ar,1"““^lb7+B'- (9,2)
Подставляя полученное выражение (9.12) в уравнение (9.10), после несложных преобразований будем иметь:
1Аг]0мин==5|[Ат]0+-1 ^^+**[Ат]р+/С/С*[Ат]?} . (9.13)
Минимальное значение правой части уравнения (9.13), равное S/К и соответствующее предельной чувствительности для кривой титрования, достигается при выполнении следующих условий:
[Ат]0<^—L; Ж-i; [Ат]РАС*<^1; К К* [Ат]р<^ 1,
К [Ат]р
так как [At]f=[At]0—В*, то условие [At]0«{At]f адекватно условию В»<С[Ат]0> a [At]fK*<C1—условию [Ат]0<^-^-
229
• Таким образом, для максимального приближения калибровочной зависимости к -кривой титрования концентрация центров связывания должна быть меньше констант диссоциации комплексов антител с определяемым и меченым антигенами, а степень заполнения антител меченым антигеном должна быть крайне низкой. Последнее положение логически понятно, так как влияние меченого антигена на связывание определяемого антигена должно быть пренебрежимо мало. Однако реально это требование трудно выполнимо из-за сложности достоверной регистрации изменения концентрации метки в комплексе с антителами при варьировании концентрации определяемого антигена. Если считать достаточно малыми такие значения параметров, при которых нижний предел детекции антигена увеличивается вдвое по отношению к минимальному и составляет 2/К, то рассмотренные выше условия следует записать в виде
1Ат10<-1; [Ат]0<-^; В*<-^. (9.14)
• Таким образом, начальная концентрация центров связывания должна быть меньше значения константы диссоциации комплекса антиген — антитело (если эти значения для меченого и определяемого антигенов различны, то минимальной из них), а концентрацию меченого антигена следует выбирать такой, чтобы при достижении равновесия в отсутствие определяемого антигена им заполнялось не более половины центров связывания антител.
Из рассмотрения изотермы связывания меченого антигена с антителами следует, что условия В*<[Ат]0/2 и [Ат]0< 1//С* могут выполняться* одновременно только при [Аг*]0< I/К*. Если популяция антител гетерогенна по аффинности к антигену, то концентрацию меченого антигена следует выбирать такой, чтобы условие В*<[Ат]0/2 выполнялось для высокоаффинной фракции антител, определяющей чувствительность анализа.
В зависимости от структуры и молекулярной массы антигена при введении ферментной метки его константа связывания с антителами может увеличиваться, уменьшаться или оставаться неизменной. Увеличение эффективного значения константы связывания может быть обусловлено образованием в результате химической модификации олигомеров меченого антигена, формирующих при взаимодействии с антителами сложные по составу комплексы. Уменьшение сродства может наблюдаться при экранировании ферментом части антигенных детерминант либо в результате кон-формационных изменений, возникающих из-за образования ковалентных связей.
Следует отметить, что в идеальном случае, при котором предполагается наличие молекул антител строго одной аффинности и отсутствие неспецифических взаимодействий, одинаковая чувствительность может быть достигнута при любых соотношениях меж-
230
ду константами связывания меченого (К*) и определяемого (К) антигенов. Для этого следует выбирать соотношение концентраций компонентов, соответствующее условиям (9.14). Иллюстрация этого положения приведена на рис. 31.
