Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
J01min
Рис. 30. Калибровочный график определения аитигеиа:
по оси абсцисс — начальная концентрация аитигеиа 1Аг]0; по оси ординат — концеит-
ляемая концентрация антигена, соответствует уменьшению концентрации связанного меченого соединения при отсутствии в системе определяемого антигена (В* при аНЗЛИЗИруеМОГО СОвДИНеНИЯ, КО*
к;оГе0имер"нТИ(Н5У*в?,ревышаЮ1ДУЮ °шиб' торый зависит от константы связывания используемых антител, соотношения концентраций при анализе и условий проведения реакции (температура, pH, концентрация детергента, природа буфера и т. д.). Чувствительность на втором этапе определяется активностью фермента и чувствительностью метода детекции продуктов ферментативной реакции.
Мы определили чувствительность как минимальную концентрацию, достоверно регистрируемую в данном анализе. Под термином «достоверно» подразумевается то, что параметр ферментной реакции (начальная скорость реакции, оптическая плотность продукта за фиксированный промежуток времени и т. д.), регистрируемый в присутствии «минимальной» концентрации анализируемого соединения, превышает параметр «фоновой» реакции (т. е. реакции в отсутствие антигена) на величину, большую, чем ошибка измерения (рис. 30).
224
Таким образом, экспериментально нижний предел обнаружения может быть установлен только на основе построения доверительных интервалов для «фоновой» и начальных точек калибровочного графика, при этом каждая точка должна дублироваться статистически достоверное число раз. Ширина доверительного интервала зависит от разброса показаний в параллельных пробах; поэтому высокая чувствительность при плохой воспроизводимости результатов достигнута быть в принципе не может.
Следовательно, предел обнаружения или чувствительность ИФА определяется физико-химическими параметрами иммунологических и ферментативных реакций, соотношением компонентов и ошибками при измерении параллельных проб на начальном участке калибровочного графика.
Точность анализа. Это параметр, с помощью которого устанавливают различия между параллельными (или последовательными) результатами анализа одной и той же пробы. Количественно точность характеризуется коэффициентом вариации, представляющим стандартное отклонение, выраженное в процентах от среднего значения. На точность анализа влияют многие факторы, в первую очередь постоянные и случайные ошибки, возникающие в ходе анализа, качество регистрирующей аппаратуры, квалификация персонала. Подробный анализ этих факторов дан в книге «Радиоимму-нологические методы» (Чард, 1980), которая может быть рекомендована всем желающим более детально ознакомиться с этим вопросом.
Среди известных биологических соединений антитела обладают уникальными свойствами распознавать антиген, против которого они получены. Но это не означает, что антитела способны связываться только с ним. Используемые в анализе антитела могут взаимодействовать с компонентами исследуемой пробы, которые близки по структуре с антигеном или даже несут одинаковые антигенные детерминанты. В связи с этим одной из характеристик иммунохимического анализа является- специфичность, отражающая степень достоверности выявления анализируемого вещества по сравнению с другими компонентами пробы. Качественно специфичность может быть охарактеризована при изучении перекрестных реакций с близкими по структуре антигенами.
При проведении конкурентного анализа перекрестно реагирующее соединение будет, подобно антигену, препятствовать связыванию с антителами меченого антигена. Один из путей оценки специфичности сводится к построению калибровочных кривых для антигена (А) и перекрестно реагирующего соединения (Б) отдельно. Если 50%-ное (или любое другое) ингибирование связывания меченого антигена достигалось при концентрации А, допустим, 10 ед/мл, а в случае Б— 100 ед/мл, то при параллельности калибровочных кривых можно считать, что перекрестная реакция с Б составляет 10%- Влияние перекрестно реагирующих соедине-
225
ний на ход анализа необходимо оценивать, исходя из их содержания в анализируемом образце. Допустим, в связи с данной чувствительностью метода необходимо анализировать пробу в разведении, обеспечивающем содержание А в концентрации 10 ед/мл. Если Б при этом также находится в концентрации 10 ед/мл, то его присутствие практически не отразится на результатах анализа. Если же Б находится в коцентрации 1000 ед/мл, то достоверное определение А на его фоне невозможно.
Время проведения. Длительность ИФА при наличии готовых реагентов и методики складывается из времени, затрачиваемого на реакцию антиген — антитело, промывку и дозировку компонентов, а также времени проведения и регистрации ферментативной реакции. При осуществлении твердофазного ИФА лимитирующей по времени стадией является доведение реакции антиген — антитело до равновесного состояния. Так как взаимодействие антитела с антигеном формально представляет обратимую реакцию второго порядка, то время приближения к равновесию возрастает с уменьшением концентрации определяемого антигена. Фактором, определяющим время достижения равновесия, является константа скорости образования комплекса антиген — антитело.
