Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
При данных условиях с колонки элюируется несколько фракций антител (рис. 29) с разными значениями констант связывания инсулина (численные значения констаит определены гомогенным методом биолюмииесцентного иммуно-кофакторного анализа с использованием инсулина, меченного АТР). Значениям pH элюции 3,8; 3.3; 2,5; 2,2; 2 соответствовали фракции с константами связывания 10-6; 3-10-7; 8-10-8; 3-10~10 М,
Рис. 29. Профиль элюции антител против инсулина с иммуносорбента на основе сефарозы-4В ступенчатым градиентом pH 4,0—2,0
(время элюции 4 ч; скорость элюции 0,25 мл/мин)
Стабильность иммобилизованных антител при хранении. Постоянство концентрации и сродства иммобилизованных антител является необходимым условием для получения воспроизводимых результатов твердофазного ИФА. Изменение этих характеристик может происходить за счет десорбции или разрыва химической связи антител с носителем и денатурации связанного белка. Экспериментально изменение концентрации или свойств иммобилизованных антител проявляется в уменьшении степени связывания в стандартных условиях- фиксированной концентрации меченого антигена.
В ИФА стабильность антитела определяется интервалом времени, в течение которого остается постоянной их способность связывать антиген. В иммуноферментных наборах, укомплектованных готовыми иммуносорбентами, период стабильности антител явля-
* Необходимо следить за тем, чтобы элюируемые с колонки антитела быстро переводились в раствор с нейтральным значением pH,
221
ется одним из основных параметров, определяющих срок годности диагностикума.
При правильном соблюдении условий хранения иммобилизованные антитела стабильны в течение достаточно длительного периода времени. Адсорбированные на полистирольных планшетах или пробирках препараты могут храниться до применения при +4°С более года. Обязательным условием является отсутствие влаги, для чего после иммобилизации необходимо тщательно высушить препарат при комнатной температуре, а затем хранить его в герметически закрытой таре в присутствии осушителя. При комнатной температуре адсорбированные антитела стабильны в течение 1,5—2 мес, что дает возможность осуществлять транспортировку готовых наборов на большие расстояния.
Стабильность иммобилизованных антител при хранении в растворе, как правило, менее высокая, что связано со смыванием белка с носителя, действием микрофлоры и т. д. Срок хранения составляет в большинстве случаев несколько месяцев.
Стабильность антител в значительной степени определяется свойствами поверхности носителя, что необходимо учитывать при выборе твердой фазы в ИФА.
Теоретические
основы
иммуноферментного
анализа
В данной главе будут рассмотрены основные количественные закономерности четырех наиболее распространенных в ИФА схем: конкурентной, метода последовательного насыщения, «сэндвич»-метода и метода определения антигенов с использованием меченых антивидовых антител.
Прежде всего дадим краткую характеристику некоторых часто используемых в анализе понятий: предел обнаружения, длительность, точность и специфичность. В зависимости от задач разрабатываемого анализа эти параметры могут варьироваться в достаточно широких пределах. Как и все иммунохимические методы, ИФА основан на реакции взаимодействия антиген — антитело, закономерности которой в значительной степени обусловливают возможность достижения необходимых значений перечисленных параметров. Каждая схема ИФА представляет определенную комбинацию иммунологических реакций, проходящих одновременно или последовательно. В связи с этим различные методы ИФА имеют свои особенности и в большинстве случаев описываются разными уравнениями. В этом разделе сначала будут кратко даны сведения об основных характеристиках ИФА, а затем более детально рассмотрены закономерности нескольких наиболее широко используемых схем анализа. Основное взимание при этом будет уделено закономерностям иммунохимических стадий анализа, что представляет интерес как для
ИФА, так и других иммунологических методов, основанных на использовании меченых соединений.
Предел обнаружения. Под пределом обнаружения в ИФА следует понимать минимальную достоверно определяемую концентрацию исследуемого вещества. Часто в литературе под этим термином подразумевают чувствительность анализа. При представлении экспериментальных данных
\Ат-Аг]
наиболее корректно выражать эту величину в концентрационных единицах (моль/л, нг/мл и т. д.). Часто встречающееся выражение в массовых единицах (например, «метод позволяет определить
1 пмоль белка», или «0,1 нг белка в пробе») затрудняет реальную оценку этого параметра, а в отсутствие указаний конечного объема анализируемой смеси де-ляет это невозможным.
При проведении ИФА можно выделить два этапа. Первый — перераспределение компонентов [Аг]0 реакционной смеси в ходе имму-нохимических реакций, число и последовательность которых определяется выбранной схемой. Второй — выявление меченого со-?^Це„^^°7л^Т“!па"ГииЛим^ь1:;Гн™;е^: единения при проведении ферментативной реакции. Оба этапа влияют на предел обнаружения
