Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 85

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 79 80 81 82 83 84 < 85 > 86 87 88 89 90 91 .. 115 >> Следующая

В ИФА титрование активных центров антител часто проводят конъюгатом антиген — фермент, в котором часть детерминант может быть экранирована маркером. В этом случае следует учитывать, что из числа доступных активных центров определяется концентрация только тех, которые специфичны к неэкранирован-ным антигенным детерминантам конъюгата.
В табл. 8.1 приведены количества иммобилизованных антител против IgG человека, определенные методом титрования иммуносорбентов конъюгатом IgG—пероксидаза. Иммуносорбенты получены с использованием носителей и методов иммобилизации, ши-
218
роко применяемых в ИФА. Данные таблицы иллюстрируют значения концентраций доступных центров связывания, которые могут быть получены при ковалентной и аффинной иммобилизации антител на пористых носителях органической и неорганической природы и адсорбционном связывании с непористым полистиролом.
Для упрощения сравнения в .таблице приведена суммарная концентрация иммобилизованных антител без деления на концентрации центров, обладающих большим и меньшим сродством к антигену. На сорбентах 1—3 иммобилизована IgG-фракция антисыворотки; на сорбенте 4 — аффинно выделенные антитела.
Таблица 8.1
Носитель Метод иммобилизации Количество иммобилизованных антител
1. Силохром G-20 мк, активированный глутаровым альдегидом 2.'Сефароза 4В, активированная BrCN 3. Сефароза с иммобилизованным IgG 4. Лунка планшета из прозрачного полистирола Ковалентный » Аффинный Адсор бционный (9,2±1,8) • 10~п моль/мг сухого сороента (2,6±0,4) • 10-11 моль/мг (2,8±0,5) • 10_и моль/мг (0,2±0,1) • К)-12 моль/см2
Константа связывания антигена с иммобилизованными антителами. Степень сродства антител к антигену, количественно выраженная константой связывания, является основным параметром, определяющим чувствительность иммунохимического анализа. Процедура иммобилизации в ряде случаев может приводить к снижению константы связывания, что является одной из отрицательных сторон твердофазного анализа. Так, при сравнительном изучении антител к инсулину показано, что константа связывания антигена с иммобилизованными антителами в 20 раз ниже, чем в растворе. Экспериментально значения констант связывания получают из опытов по титрованию активных центров антител (рис. 28).
Антитела, вырабатываемые организмом против антигенных детерминант, представляют неоднородную популяцию. Поэтому в случае поликлональных антител определяемое значение константы связывания является эффективной величиной, характеризующей образование иммунного комплекса с антителами, активные центры которых обладают различным сродством к антигену (см. гл. 2, § 2, 4). В связи с этим данные титрования в координатах (B/F-r--В), как правило, представляют криволинейную зависимость, которую можно аппроксимировать двумя прямыми (рис. 28, б), вы-
219
• делив из гетерогенной смеси антител две популяции, средние значения констант связывания антигена которых значительно отли-'аются.
Концентрация фракции антител с высоким эффективным значением константы связывания, как правило, значительно ниже, чем с низким. Для разработки суперчувствительных систем детекции бывает необходимо выделять наиболее высокоаффинную фракцию и использовать в анализе только ее. Это может достигаться путем адсорбции антител на иммобилизованном антигене и последующей их элюцией линейным или ступенчатым градиентом pH, что
Рис. 28. Титрование активных центров иммобилизованных антител против IgG-человека конъюгатом IgG — ПХ (а) и представление результатов в координатах Скэтчарда (б):
а — по оси ординат — оптическая плотность А при Я=490 им продукта пероксидазной реакции окисления о-фенилеидиамина перекисью водорода, соответствующая количеству активных центров на носителе; по оси абсцисс — концентрация конъюгата в растворе
обеспечивает последовательное смывание с колонки молекул по мере увеличения их сродства к антигену. Последними при наиболее кислых значениях pH элюируются антитела, обладающие максимальным значением константы связывания. Ниже приведена одна из возможных методик на примере фракционирования антител против инсулина.
Методика.
Сорбент получают на основе активированной бромцианом сефарозы 4В, с которой связывают инсулии ковалентно. К 2 г активированного носителя добавляют 50 мг инсулина в 30 мл буфера 0,1 М NaHC03 (pH 8,3), содержащего 0,5 М NaCl. Инкубируют при осторожном перемешивании. Контроль за связыванием белка осуществляют спектрофотометрически при Х=280 им. После окончания связывания отмывают сорбент тем же буфером. Сорбцию антител сорбентом осуществляют в проточной замкнутой системе; состоящей из колонки с сорбентом (0,4X5) см, перистальтического насоса, увикорда и пробирки с раствором IgG-фракции антисыворотки. На колонку с 1 мл сорбента с пришитым инсулином наносят 60 мг IgG-фракции и выдерживают 2 ч. Затем удаляют избыток белка и промывают колонку 45 мин 0,05 М фосфатным буфером (pH 7,3), содержащим 0,1 М NaCl, За полнотой отмывки следят по показаниям увикорда.
220
Элюцию антител проводят с использованием ступенчатого градиента в интервале pH от 4 до 2. Градиент pH создают смешением двух буферных растворов: 1 — 0,2 М К2НРО4 — лимонная кислота (pH 4,0); 2 — 0,2 М. раствор лимонной кислоты. Условия элюции: время градиента 4 ч, скорость элюции 0,2 мл/мин, число ступеней градиента 6*.
Предыдущая << 1 .. 79 80 81 82 83 84 < 85 > 86 87 88 89 90 91 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed