Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
213
не затруднительна. Способностью к адсорбции соединений различной природы в условиях проведения иммунохимического анализа в большей или меньшей степени обладают все применяемые в ИФА носители. Причина связывания зависит от природы сорбента и может быть обусловлена захватом антигенов или антител в поры носителя, а также образованием ионных, гидрофобных и других связей.
Наиболее эффективным путем подавления связывания с носителем является проведение анализа в буфере, содержащем неионные детергенты (твин-20, тритон Х-100, Х-305 и др.), а также белки, обладающие высоким сродством к центрам сорбции носителя
Рис. 25. Изменение активности конъюгата IgG — пероксидаза в растворе (начальная концентрация 4,3 нМ) в фосфатном буфере, содержащем 0,05% тритона Х-100 (/) и в том же буфере без детер-гена (2)
Рис. 26. Связывание конъюгата ин-сулина (Инс — ПХ) со специфическими (1) и неспецифическими (2) антителами морской свинки, адсорбированными на полистирольном планшете для ИФА:
по оси ордииат — оптическая плотность А при Я=490 им продукта пероксидазной реакции окисления о-фенилендиамина перекисью водорода: по оси абсцисс — концентрация конъюгата в лунках планшета
(0,1% БСА, 10% сыворотка крови и т. д.). На рис. 25 приведены зависимости, отражающие изменение связывания конъюгата IgG-пероксидаза с поверхностью полистирольных пробирок в присутствий тритона Х-100.
Предотвращение связывания белков с поверхностью кремнеземных носителей (силохром, пористое стекло) успешно достигается при их модификации йоливинилпирролидоном. Используется Также предварительная блокировка центров сорбции носителя после иммобилизации антител или антигена инертными белками (альбумин, у-глобулин и др.), которые следует выбирать с учетом возможности Их связывания с анализируемым антигеном. Например, альбумин способен эффективно адсорбировать эстрадиол. Очевидно, что блокировка носителя альбумином при анализе эстра-диола может привести только к увеличению вклада неспецифических вэаимодействий.
214
Как правило, при проведении ИФА интерес представляет знание неспецифического связывания компонентов не с нативным носителем, а с иммуносорбентом — модифицированным носителем с иммобилизованными антителами (антигеном). В ряде случаев сама процедура модификации приводит к снижению степени связывания. Например, активированный- у-аминопропилтриэтоксисила-ном силохром в меньшей степени адсорбирует IgG, чем исходный носитель, что, по-видимому, связано с частичным экранированием отрицательного заряда и увеличением гидрофобности поверхности за счет присоединения молекул силана.
После иммобилизации антител (антигена) часть центров сорбции носителя экранируется связанным белком и становится недоступным для взаимодействия с компонентами анализируемой пробы и ферментным конъюгатом. В связи с этим наиболее ценную для анализа информацию дает сравнение эффективности сорбции меченного пероксидазой инсулина на двух иммуносорбентах, один из которых содержит иммобилизованные специфические антитела, а другой — антитела неиммунизированного животного* (рис. 26). Подобный эксперимент позволяет учесть суммарное неспецифическое связывание с носителем и иммобилизованными иммуноглобулинами, но не дает возможность различить эти два эффекта.
Неспецифическое связывание меченого соединения в значительной степени обусловлено его концентрацией, концентрацией иммуносорбента и временем их контакта. Оптимальные соотношения этих факторов в каждом конкретном случае надо выбирать экспериментально. Однако очевидно, что уменьшение концентрации меченого соединения и проведение анализа в кинетическом режиме должно способствовать уменьшению неспецифического связывания. Реально возможность его снижения таким путем зависит от требуемой чувствительности анализа и соотношения • констант скоростей образования специфического и неспецифического комплексов.
Механизм неспецифических эффектов в ИФА в настоящее время изучен' далеко не полностью. Несмотря на существование перечисленных выше действенных путей подавления неспецифического связывания с иммуносорбентом, отнюдь не всегда понятно, за счет чего достигнут требуемый эффект. В связи с этим оптимизация этого важного для анализа параметра чаще всего проводится. эмпирическим путем и подходы подавления неспецифического связывания, эффективные для одного объекта, не гарантируют аналогичных результатов при переходе к другому даже в том случае, когда в качестве твердой фазы применяется один и тот же носитель.
* При этом желательно, чтобы животные были из одной популяции н содержались в одних условиях,
215
Например, одна из широко реализуемых схем ИФА («сэндвичи-метод) основана на использовании иммобилизованных антител, которые связывают определяемый антиген, после чего он выявляется конъюгатом антител с ферментом. Этот метод можно применять в том случае, если в отсутствие антигена концентрация меченых антител, неспецифически связавшихся с иммуносорбентом,
значительно меньше, чем в его присутствии. С формальной точки зрения, при условии постоянства носителя, методов получения и концентраций реагентов, а также условий проведения анализа регистрируемый параметр «фоновой» реакции (иммобилизованные антитела + меченые антитела) для антител, специфичных к разным антигенам, должен быть одинаков. Реально эта величина колеблется в достаточно широких пределах, а в некоторых случаях аномально зависит от концентрации компонентов. Иллюстрирующие последнее положение зависимости приведены на рис. 27. Как видно из графика, уменьшение эффективности связывания меченых антител против инсулина наблюдается только при значительном уменьшении концентрации антител на фазе. Использование рекомендуемых обычно концентраций антител при адсорбции (»5 мкг/мл) приводит к существенному увеличению регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции, что делает невозможным чувствительное определение анализируемого антигена. Экспериментально подтверждающего объяснения подобного аномального «средства» иммобилизованных и меченых молекул антител пока не найдено. Не исключено, что в некоторых случаях данный эффект может быть связан с наличием в сыворотке антиидиотипических антител (антител к специфическим антителам), которые вместе с другими IgG метятся ферментом. Один из путей снижения неспецифического связывания конъюгата в «сэндвич»-методе— использование для адсорбции и метки антител разных видов животных.
