Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 82

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 76 77 78 79 80 81 < 82 > 83 84 85 86 87 88 .. 115 >> Следующая

211
диняют фракции первого пика (иммуносорбент) и диализуют против 0,01 М К-фосфатного буфера (pH 7,4) с 0,1 М NaCl в течение ночи при 4°С.
Выделенный иммуносорбент при хранении при +4°С может быть использован для анализа в течение нескольких месяцев.
Иммобилизация антител микрокапсулированием. При ковалентной или адсорбционной иммобилизации часть активных центров антител может снижать или полностью утрачивать способность взаимодействовать с антигеном. Эффективным путем сохранения нативной структуры антител является иммобилизация микрокапсулированием, широко используемая для получения препаратов ферментов, антигенов (для обеспечения пролонгированного эффекта при иммунизации) и лекарств для достижения их направленного транспорта в организме.
Принцип разделения компонентов в анализе с применением микрокапсулированных антител основан на том, что продиффун-дировавший внутрь капсулы и связавшийся с антителами меченый антиген теряет способность переходить обратно в раствор вследствие ограниченного размера пор. Как следует из принципа разделения, микрокапсулирование для целей анализа не является универсальным подходом. Эффективное применение таких препаратов антител возможно только при использовании в анализе низкомолекулярных антигенов, меченных небольшими по размерам метками (изотоп, кофактор), что обеспечивает свободную диффузию конъюгата антиген — маркер внутрь капсулы.
§ 3. Иммобилизация антигенов
Как и антитела, антигены могут быть ковалентно связаны с носителем либо адсорбированы на нем. Многообразие соединений, которые могут являться антигенами, затрудняет выработку каких-либо единых рекомендаций. Выбор метода связывания антигена с носителем зависит от структуры и молекулярной массы соединения.
Адсорбционная иммобилизация антигенов. Многие макромоле-кулярные антигены — пептидные гормоны, белки, ферменты, липо-полисахариды, денатурированная ДНК и' т. д., а также целые вирусные частицы, компоненты клеток (например, рибосомы) и целые клетки—могут быть связаны с поверхностью полимерных и неорганических носителей путем адсорбции в условиях, идентичных описанным для иммобилизации антител. Различия чаще всего относятся к оптимальным значениям pH, которые могут изменяться от нейтральных до щелочных (pH 6,8—9,6) в зависимости от заряда сорбируемой молекулы. Длительность процесса адсорбции и максимальное количество связанного с поверхностью антигена являются характеристиками, индивидуальными для каждого процесса и зависящими от гидрофобности, заряда и молекулярной массы молекулы. Однако для многих антигенов время, необ-
212
ходимое для связывания, например с поверхностью непористого полистирола, не превышает 2—4 ч и уменьшается при повышении температуры от 4 до 37°С.
В ряде случаев прямая адсорбция антигена на поверхности полимерных носителей невозможна или нежелательна. Чаще всего с подобной ситуацией приходится встречаться, когда антигенами являются низкомолекулярные соединения, имеющие одну антигенную детерминанту, например лекарственные препараты, пестициды, некоторые стероидные и тироидные гормоны и т. д.
• При адсорбции таких молекул могут возникать следующие сложности: 1) в силу своих свойств гаптен не сорбируется на пластике; 2) гаптен водонерастворим и может быть адсорбирован только из органического растворителя, растворяющего полимер и приводящего к ухудшению оптических свойств; 3) гаптен адсорбируется в мягких условиях, но его детерминанта становится стери-чески недоступной для последующего взаимодействия с антителами.
В указанных случаях гаптен целесообразно адсорбировать, предварительно ковалентно связав с макромолекулярным белком-носителем, который впоследствии прочно связывается с полимером.
• При получении такого конъюгата необходимо: 1) исключить возможность модификации групп, образующих антигенную детерминанту; 2) использовать в качестве белка-носителя другой белок, а не тот, который применялся при синтезе конъюгата гаптен-носи-тель при иммунизации; 3) по возможности стремиться применять сшивающий реагент, отличный от используемого при получении конъюгата для иммунизации с целью избежания связывания адсорбированным конъюгатом антител, специфичных не к гаптену, а к участку связывания гаптена с белком-носителем.
Ковалентное связывание. Иммобилизацию антигенов путем ковалентного связывания проводят, используя подходы, разработанные для получения нерастворимых производных антител и ферментов. Выбор сшивающего агента и метода связывания необходимо проводить с учетом доступных функциональных групп, модификация которых не снижает способность агента эффективно взаимодействовать с антителами.
§ 4. Неспецифическое связывание с иммуносорбентом
Важной задачей при проведении анализа с применением иммуносорбентов является максимальное снижение связывания меченного ферментом соединения и других компонентов с поверхностью носителя и пробирок, в которых проводится измерение. При определении микроколичеств веществ интерпретация результатов анализа при значительной неспецифической сорбции (связывание в отсутствие специфических антител) край-
Предыдущая << 1 .. 76 77 78 79 80 81 < 82 > 83 84 85 86 87 88 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed