Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Методика адсорбции антител.
Для адсорбции могут быть использованы IgG-фракции антисыворотки либо антитела, выделенные известными методами.
В лунки планшетов для ИФА вносят по 0,2 мл раавора белка в 0,01 М К-фосфатном буфере (pH 7,4) с 0,1 М NaCl (PBS) с концентрацией 5 мкг/мл. Планшеты накрывают крышками и выдержлватот ночь при + 4°С*. Удаляют-белок и промывают лунки 3—4 раза раствором ФБ, содержащим 0,05% детергента твин-20 или тритон Х-100. Подготовленные таким образом планшеты готовы для проведения ИФА. При необходимости длительного хранения планшеты высушивают на воздухе и хранят при +4°С (в герметически закрытых пластиковых пакетах в присутствии осушителя). При соблюдении правил хранения адсорбированные антитела могут использоваться для анализа в течение нескольких месяцев.
* Проведение адсорбции в течение ночи является удобным в методическом плане с точки зрения планирования времени анализа. Как указывалось ранее, при дайной концентрации белка длительность процесса адсорбции можно ограничить несколькими часами,
209
Аффинная иммобилизация антител. Выделение специфических антител из сыворотки включает стадию их адсорбции на иммобилизованном антигене и последующую элюцию путем разрушения связи антиген — антитело при сильно кислых или щелочных значениях pH либо концентрированными растворами солей (например, NH4CNS). Выделение в столь экстремальных условиях может неблагоприятно сказываться на аффинности антител, а последующее ковалентное или адсорбционное закрепление молекул на носителе в ряде случаев приводит к дальнейшему снижению способности эффективно связывать антиген.
Рис. 24. Схема получения иммобилизованных антител:
а — через связь аитигеи — антитело; б — дополнительно ковалентно связанных с антигеном глутаровым альдегидом
Отсюда определенный интерес представляет использование в анализе иммуносорбентов, полученных путем аффинного связывания специфических антител с иммобилизованным на носителе антигеном. Связь антиген — антитело обратима, поэтому для предотвращения смывания антител с сорбента разработаны пути последующего ковалентного закрепления молекул, образовавших специфический комплекс на носителе. Для стабилизации комплекса эффективно применяются обычные сшивающие агенты: глута-ровый альдегид, диазиды, изоцианаты. Процедура иммобилизации включает инкубацию связанного с носителем антигена с антисывороткой, отмывку носителя, проведение реакции с сшивающим антигеном и заключительную отмывку для удаления избытка (рис. 24). Процесс может проводиться как в реакторах перемешивания, так и в колоночном режиме. Данный подход детально изучен на примере иммобилизации антител против сывороточного альбумина человека на сефарозном сорбенте. В результате такого связывания по крайней мере половина активных центров иммобилизованных антител способна принимать участие в последующих реакциях с антигеном, что является недостатком метода. Однако
210
возможность быстрого получения «чистых» иммобилизованных антител делает его перспективным для целей ИФА.
Иммобилизация антител на магнитных носителях. Ранее отмечалось, что одним из недостатков применения для целей анализа иммуносорбентов на основе гранулированных носителей являются методические сложности, связанные с точным- дозированием, центрифугированием, потерями при промывках и т. д. Многие сложности могут быть устранены при использовании носителей, обладающих магнитными свойствами.
Наиболее распространены носители на основе оксидов железа и феррита бария. Магнитный носитель также может быть получен на основе полиакриламида и агарозы путем добавления Fe3C>4 в смесь мономеров при полимеризации. Последующая иммобилизация антител на магнитных носителях может проводиться одним из описанных ранее методов. Магнитные носители позволяют проводить разделение компонентов анализируемой смеси во многих образцах одновременно без применения центрифугирования, исключить потери сорбента при промывках и в значительной степени автоматизировать процедуру анализа.
• Изменяющиеся устройства для проведения анализа с магнитными носителями позволяют одновременно анализировать несколько десятков образцов с быстрым переносом и промывкой частиц сорбента, а также одновременную для всех проб остановку ферментативной реакции, что существенно для получения хорошей воспроизводимости результатов ИФА.
Иммобилизация антител на водорастворимых полимерах. Новым подходом в иммунохимическом анализе является применение антител, иммобилизованных на обратимо растворимых иммуносорбентах, что позволяет проводить анализ в растворе, а затем быстро разделять компоненты путем перевода носителя в нерастворимое состояние. Данный путь дает возможность сочетать чувствительность твердофазного анализа с быстротой гомогенного. В качестве водорастворимого носителя может быть использован альгинат натрия и полиметакриловая кислота (ПМАК).
Методика получения водорастворимого иммуносорбента на основе ПМАК-
Используют полученную радикальной полимеризацией ПМАК с МГ=26П0. Раствор ПМАК с концентрацией 10 мг/мл доводят до pH 5,0 2 М КОН. Добавляют 15 мг водорастворимого карбодиимида п 10 мг N-оксисукцинимида. Смесь инкубируют 30 мин при 20 °С при перемешивании, поддерживая значение pH 5,0. Затем 1 М КОН доводят pH до 7,8—8,0 и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Добавляют 20 мг IgG в 0,01 М К-фосфатном буфере (pH 7,8), содержащем 0,1 М NaCl, инкубируют 2 ч при комнатной температуре и перемешивают, контролируя и поддерживая pH 7,8-*-8,0. Затем диализуют в течение ночи против 0,1 М Na-фосфэтного буфера (pH 5,5) с 0,42 М NaCl. Несвязав-Щийся IgG Отделяют гельфильтрацией на колонке (2X100) см с ультрагелем АсА-44, уравновешенным 0,1 М Na-фосфэтным буфером (pH 5,5) с 0,4 М NaCl. Выход компонентов регистрируют спектрофотометрически при ?.=280 нм, Объе-
