Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 77

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 71 72 73 74 75 76 < 77 > 78 79 80 81 82 83 .. 115 >> Следующая

ГК с2® П 1280 >
^280еАТР ~’ 267sATP
где D280, D267, б280, б267 — оптические плотности конъюгата АТР-инсулин и коэффициенты молярного поглощения для индивидуальных веществ при длинах волн 280 и 267 нм соответственно.
Содержание белка в конъюгате АТР — инсулин также определяют по методу Луори. Препарат конъюгата хранят при —20°С. Коферментативную активность определяют биолюминесцентным методом со светляковой люциферазой.
8
Получение и свойства иммобилизованных антител и антигенов
Гетерогенные методы ИФА включают стадию разделения свободного меченого компонента от образовавшегося комплекса со связывающим агентом. Задача разделения эффективно решается при использовании антител (или антигенов), иммобилизованных на нерастворимых носителях. Методы, основанные на данном подходе, известны под названием твердофазных методов ИФА.
Получение антигенов и антител, связанных с Носителем, является одной из существенных процедур при разработке твердофазного ИФА, так как от степени сохранения стабильности и активности иммобилизованных препаратов зависят количественные характеристики метода и возможность его практического применения. Другой важной областью применения иммунот сорбентов для целей ИФА является очистка антигенов и антител для последующей метки ферментом или использования в качестве стандартного образца.
В связи с интенсивным применением иммобилизованных ферментов в биотехнологии методы получения различных нерастворимых производных соединений белковой и небелковой природы хорошо разработаны. Многие из них могут быть эффективными и для получения-иммобилизованных препаратов антител и антигенов (иммуносорбентов) . Чаще всего для целей твердофазного ЙФА приготовление иммуносорбентов осуществляют либо ковалентным связыванием, либо адсорбцией вещества на поверхности носителя.
§ 1. Носители, применяемые в иммуноферментном анализе
• Используемые в ИФА носители должны соответствовать ряду требований, обусловленных спецификой метода: 1) быть нерастворимыми при условиях, в которых проводится анализ; 2) обладать достаточной для аналитических целей емкостью (т. е. количеством иммобилизованного белка на единицу массы или площади поверхности носителя); 3) обеспечивать прочное необратимое связывание белка с носителем и стабильность препарата при хранении; 4) обладать минимальной способностью к неспецифическому связыванию компонентов, находящихся в анализируемых биологических жидкостях; 5) быть удобным для анализа в методическом плане, т. е. легко и точно дозироваться, быстро осаждаться, без потерь подвергаться процедурам промывки и т. д.
Перечисленным требованиям соответствуют многие носители, в том числе и широко используемые в биохимических лабораториях для очистки и разделения белков. В связи с этим первоначально в гетерогенных методах ИФА применялись такие носители, как целлюлоза, сефароза, сефадекс, биогель, силохром, пористое стекло, оксиды металлов. Эти материалы обладают высокой емкостью, легко подвергаются химической модификации, имеют хорошие гидродинамические свойства. Неорганические носители (силохром, пористое стекло) не подвержены воздействию микрофлоры, что позволяет использовать иммобилизованные, на них антитела длительный срок без применения консервантов. Одним из немногих (но существенных) недостатков гранулированных носителей является сложность их точного дозирования и трудность промывок без потерь используемых в анализе микроколичеств иммуносорбента. Особенно остро эти вопросы встают при необходимости проведения не единичных, а массовых анализов.
• С начала 70-х годов в практику ИФА вошли методы, основанные на иммобилизации антител и антигенов цепосредственно на стенках посуды, в которой проводится анализ. В основном для такого анализа используют пробирки и планшеты из непористых полимерных материалов — полистирола, поливинилхлорида, полиметакрилата и т. д. Многие вещества (белки, полисахариды, пептидные гормоны, липополисахариды, денатурированная ДНК ит. д.) могут быть адсорбционно связаны с поверхностью таких полимеров, что значительно упрощает процедуру иммобилизации. В настоящее время этот подход является одним из основных в практике твердофазного ИФА. Широкое применение метода обусловлено его простотой и возможностью автоматизации за счет того, что каждая пробирка или лунка планшета является отдельным реактором, в котором проходят все стадии анализа, начиная с иммобилизации антител (или антигена) и кончая измерением фи-
202
зико-химического параметра ферментативной реакции. К недостаткам данного подхода относится невысокая емкость непористых материалов и возможность элюции части адсорбированного белка с подложки в процессе инкубаций и промывок, вследствие чего ухудшаются чувствительность, точность и воспроизводимость результатов анализа.
Основным фактором, обусловливающим возможность проведения анализа и корректной интерпретации его результатов, является однородность сорбционных свойств пробирок или планшетов для ИФА. В связи с этим производство данных материалов требует специально отлаженной технологии, включающей строгий контроль качества изготовляемой продукции.
Предыдущая << 1 .. 71 72 73 74 75 76 < 77 > 78 79 80 81 82 83 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed