Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 76

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 70 71 72 73 74 75 < 76 > 77 78 79 80 81 82 .. 115 >> Следующая

и др. В качестве меток используют чаще всего люминол, изолюми-нол или их производные. Синтезы их конъюгатов с антителами (антигенами) проводят в мягких условиях, чтобы сохранить их иммунологические свойства. Для конъюгирования применяют реакционноспособные производные субстратов, которые получают обычными методами тонкого органического синтеза. Ниже будут приведены лишь схемы и методики получения таких конъюгатов.
Люминол и изолюминол диазотируют в мягких условиях, и полученное диазопроизводное взаимодействует с тирозиновыми и триптофановыми остатками антител:
KN°2
на
Синтез конъюгата антител с люминолом.
К охлажденной до 0°С суспензии 1 ммоля люминола в 5 мл 1 н. НС1 добавляют по каплям при перемешивании в течение 15—20 мин 1,5 ммоля К.М02 в 1 мл воды. При этом цвет раствора изменяется от желтого до оранжевого. Избыток нитрующей смеси удаляют добавлением нескольких капель 1 М мочевины. К раствору IgG (15 г/л) в PBS при охлаждении до 4“С добавляют раствор диазолюминола, доводят pH растзора до 9,0 1 М К?С03 и перемешивают 24 ч при 4 °С. Полученный конъюгат очищают на колонке (30X2,5) см с носителем Ultragel А4 в PBS.
Для получения конъюгатов часто применяют коммерчески доступное производное изолюминола — Ы-(4-аминобутил)-Ы-этил-изолюминол (ABEI). Это соединение содержит аминогруппу, участвующую в связывании с белком. Известно два способа модификации: 1) с помощью тиофосгена или 2) через активированный ге-мисукцинимидный эфир по схемам:
Способ 1
(ch2)4nh2
.'сг^5
(CH2)4NHCSC.
Н2
ДВЕ!
HN‘
HN.
/С2Н5
\ch2)4nhcsnh—(0)
197
Способ 2
(CH2)4NH2
(CH2)4NHCOCH2CHjCOOH
ABEI
(ch2)4nhcoch2ch2coon;
b
\cH2)4NHCOCH-,CH2—CONH—(IgC)
Синтез конъюгата антител с ABEI.
К раствору 18,5 мг (50 мкмоль) гемисукцинимидного производного ABEI в 800 мкл диметилформамида добавляют 5,75 (50 мкмоль) N-оксисукцинимида и затем 30,9 мг (150 мкмоль) дициклогексилкарбодиимида в 200 мкл диметилформамида. Реакционную смесь инкубируют в темноте 20 ч, удаляют осадок и добавляют 100 мкл этого раствора к 1 мл раствора IgG (15 г/л) в PBS. Инкубируют смесь 24 ч при 4°С в темноте, удаляют образовавшийся осадок и хроматографируют на колонке (30X2,5) см с носителем. Ultragel А4 в 0,05 М трис-HCl буфере, pH 8,0.
Синтез конъюгата антител с производными изолюминола.
К суспензии 100 мг ABEI в 15 мл смеси вода — хлороформ (2 : 1) при 0 "С добавляют 2 мл CSC12 в хлороформе (1 : 19). Смесь перемешивают 6 ч при 4°С, отделяют органическую фазу и упаривают под азотом. Остаток растворяют в СНС13> фильтруют и снова упаривают под азотом. Раствор 2,67 мг полученного производного изолюминола в 100 мкл диметилформамида добавляют к 1 мл IgG (10 г/л) в 0,1 М карбонатном буфере, pH 9,5, и инкубируют 12 г при 4°С. Конъюгат диализуют или хроматографируют на колонке (30x1) см с сефадексом G-50 в PBS.
В люминесцентном иммунокофакторном анализе (ЛИКА) используются конъюгаты антигенов и антител с кофакторами АТР и NAD. Общая схема синтеза конъюгатов состоит в модификации кофактора введением СООН-группы с последующим ковалентным связыванием ее с молекулой антигена (или антитела). Ниже при-
198
ведена схема модификации АТР по методу Мосбаха и получения его конъюгата с инсулином:
2. 0-СООН ~N==C=NR.
Р
—он о
0—
%
соо
NH2(CH2)6NH2
(tos)—CONH (CH2)6NH2
nhch2coo
У1
з- DO / +
N N
CONH(CH2)6NH2
nhch2conh (CH2)6NHCO—(ы)
Синтез конъюгата АТР с инсулином.
5 г АТР (8,3 ммоля) добавляют к 100 мл водного раствора монойодуксус-ной кислоты (15 г, 80 ммолей), который предварительно нейтрализуют 2 М LiOH до pH 6,5. Смесь инкубируют при 30 °С в течение 7 дней в темноте, поддерживая pH 6,5 с помощью LiOH. Получившееся N'-карбоксиметильное производное АТР (ATP-N'-CM) осаждают при —20°С добавлением 800 мл этанола, отфильтровывают, промывают спиртом и высушивают в вакууме.
100 мл раствора ATP-N'-CM прогревают пр'и 90 °С в течение 1,5 ч, поддерживая pH 8,5 с помощью LiOH. Полученный продукт охлаждают, нейтрализуют 1 М НС1 до pH 2,75 и наносят иа колонку (2,5X60) см с DOWEX 1X2 (С1_). Примеси элюируют 0,3 М LiCl, pH 2,75, а конечный продукт — линейным градиентом растворов 2 л 0,3 М LiCl, pH 2,75, и 2 л 0,5 М LiCl, pH 2,0. Фракцию, содержащую ATP-N'-CM, нейтрализуют 1 М LiOH, концентрируют на роторном испарителе до 50 мл объема, осаждают 500 мл охлажденной до 4 °С смесью ацетон — этанол (1:1) и высушивают в вакууме. Выход составляет 50—60%.
10 мг инсулина растворяют в 2,6 мл 0,01 М фосфатного буфера, pH 7,4, добавляют 30 мг солянокислого гексаметилендиамина и 15 мг водорастворимого карбодиимида и 25 мг N-оксисукцинимида. Смесь инкубируют 1 ч при 4°С. Реакционную смесь диализуют 4 ч против 0,01 М фосфатного буфера, pH 7,4.
К полученному раствору инсулина с гексаметиленовон «ножкой» добавляют 30 мг ATP-N'-CM, 15 мг водорастворимого карбодиимида, 25 мг N-оксисукцинимида и инкубируют 12 ч при 4°С. Реакционную смесь диализуют. Выход продукта определяют спектрофотометрически.
Расчет мольного соотношения инсулина и АТР в конъюгате проводят по формуле
П =280 Ги -267 _ ^267 инс. ^260еинс.
Предыдущая << 1 .. 70 71 72 73 74 75 < 76 > 77 78 79 80 81 82 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed