Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 68

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 62 63 64 65 66 67 < 68 > 69 70 71 72 73 74 .. 115 >> Следующая

Затем в каждую лунку покрытого антигеном планшета для микротитрования добавляют растворы, содержащие количества моноклональных антител, определённые в предыдущих экспериментах. Если оптическая плотность, полученная при инкубации антигена с парой антител, близка к сумме оптических плотностей, полученной для каждого моноклонального антитела в отдельности при насыщении, то это означает, что два антитела связываются с антигеном одновременно. Если же оптическая плотность близка к достигаемой, каждым раствором антитела по отдельности, то они конкурируют за связывание с одним и тем же центром на антигене. Количественно полученные результаты выражают с помощью ин-
174
декса аддитивности (ИА):
, Aj + Ач А|_|_2 —-
ИА =---100%, (6.1)
А, + А 2
(Ах+Аа)-
где А\, А2 и Аi+2 — оптическая плотность, измеряемая в непрямом твердофазном иммуноферментном тесте с первым антителом в отдельности, вторым антителом в отдельности и двумя антителами вместе.
Если два антитела связываются с одним и тем же центром, то Ai+2= (Ai + А2)/2, и ИА=0. Если же два антитела связываются независимо с различными участками, A1+2=(Ai + A2) и индекс аддитивности должен быть равен 100%.
Отбор моноклональных антител по константам связывания с антигеном. Для количественного определения антигенов, содержащихся в биологических жидкостях в низких концентрациях, необходимо иметь моноклональные антитела с высокими константами аффинности. При этом для отбора соответствующих гибридом на сравнительно ранних стадиях их получения важно, чтобы применяемые методы определения констант не зависели от больших количеств антител. Достаточно удобным для этих целей является ранее описанный выше метод Фрикста.
Методы получения конъюгатов
для иммуноферментного анализа
В ИФА используются конъюгаты антигеноЕ (гаптенов) и антител с различными белками, синтетическими полимерами, ферментами и их субстратами и кофакторами.
• Отметим основные задачи ИФА, связанные с необходимостью синтеза конъюгатов:
1) получение специфических антисывороток к низкомолекулярным соединениям— гаптенам;
2) получение меченных ферментом или субстратом антигенов (гаптенов) и антител;
3) получение иммобилизованных на твердой фазе гаптенов через конъюгат гап-тен-носитель (белок, полимер).
Разработка высокочувствительных и специфических методов ИФА связана с необходимостью получения конъюгатов, обладающих определенными характеристиками, в В этой связи можно сформулировать основные требования, которым должны удовлетворять методы синтеза различного рода конъюгатов:
1) должны сохраняться ферментативные, иммунологические или антигенные свойства конъюгата;
2) конъюгат должен легко выделяться из реакционной смеси при использовании соответствующих методов очистки;
3) выход конъюгата должен быть достаточно высоким;
4) конъюгат должен быть определенного состава;
5) полученный конъюгат должен быть стабильным при хранении.
§ 1. Синтез конъюгатов гаптенов с носителями для получения антител
Для того чтобы гаптен обладал иммуноген-ными свойствами, необходимо получить конъюгат гаптена с высокомолекулярным носителем. В качестве носителей обычно используют бычий сывороточный альбумин (БСА), альбумин сыворотки Человека, овальбумин, тироглобулин и синтетические пептиды типа полилизина. Особых преимуществ у какого-либо носителя не отмечено и поэтому чаще всего им является наиболее доступный белок — БСА. Для хороших иммуногенных свойств конъюгата важно число молекул гаптена, конъюгированных с носителем. Показано, что слишком малое и слишком большое количество молекул гаптена, пришитых к носителю, ухудшает иммуногенные свойства. Для конъюгирования с БСА, по-видимому, наиболее оптимально вводить 10—20 молекул гаптена на молекулу носителя.
Известно несколько способов нахождения количества молекул гаптена, пришитых к носителю. Самый простой спектрофотометрический способ заключается в регистрации изменения поглощения раствора конъюгата при определенной длине волны по сравнению с исходным белком-носителем. Можно также рассчитать соотношение компонентов конъюгата из данных по молекулярной массе, полученных электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии доде-цилсульфата натрия или по аминокислотному гидролизу конъюгата. Если конъюгат получили путем пришивки гаптена к аминогруппам белка-носителя, то его состав можно определить по титрованию свободных аминогрупп в исходном белке и конъюгате. Наиболее точный расчет состава конъюгата получается с помощью радиоизотопного метода, в котором используют меченный радиоактивным изотопом гаптен.
Кроме количества молекул гаптена, конъюгированных с носителем, важно также, через какую группу связывается гаптен с носителем. Специфичность иммуногена будет тогда выше, когда функциональные группы гаптена (антигенные детерминанты) удалены от места связывания с носителем. Этот факт необходимо учитывать, например, при получении конъюгатов стероидов с носителем.
Методы конъюгирования гаптенов с носителями чаще всего основаны на образовании ковалентной пептидной связи между карбоксильной группой гаптена и аминогруппой носителя или, наоборот, аминогруппой пептида с СООН-группой носителя. Если же гаптен не содержит активной функциональной группы, то ее «вводят» различными химическими способами.
Предыдущая << 1 .. 62 63 64 65 66 67 < 68 > 69 70 71 72 73 74 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed