Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Специфичность моноклональных антител. Основным свойством, на котором основано применение моноклональных антител в иммуноанализе, является высокая специфичность взаимодействия. Поликлональные антисыворотки часто имеют высокую перекрестную реактивность, что делает затруднительным и даже невозможным
170
их использование в иммуноанализе. Такая ситуация реализуется при дифференциальной диагностике гипофизарных гормонов: человеческого гонадотропина, фолликулстимулирующего, лютеинизи-рующего и тиреотропного гормонов. Эти гликопротеины состоят из двух субъединиц а и {5. а-Субъединица имеет первичную структуру, идентичную для всех гормонов, а {5-субъединица— различную. Использование поликлональных антисывороток, содержащих антитела к обеим субъединицам, делает невозможным количественное определение этих гормонов в крови из-за высокой перекрестной реактивности. Однако если в качестве аналитических реагентов применять моноклональные антитела к {5-субъединице, каждый гормон может быть определен с высокой степенью точности. Более того, использование пары моноклональных антител, одно из которых направлено к (3-субъединице и иммобилизовано на нерастворимом носителе, а другое —к а-субъединице и помечено ферментом, позволяет определять концентрацию физиологически активных форм гормонов. В крови присутствуют как физиологически активные а, {5-димеры, так и неактивные а и |3-мономеры. Поликлональные антисыворотки, выработанные к изолированной {5-субъединице, выявляют в крови неактивную {5-субъединицу, что приводит к ошибкам при диагностическом определении.
Использование моноклональных антител впервые дало возможность со 100%-ной специфичностью определять раковоэмбриональный антиген, который представляет собой гликопротеин с Мг= = 200 000, несущий на своей поверхности множество эпитопов. Часть этих эпитопов является общей с другими белками, кроме того, на поверхности гликопротеина имеется еще несколько антигенов, отличных от раковоэмбрионального, которые входят в состав незлокачественных опухолей и здоровых тканей.
Иммунизация животных высокоочищенным раковоэмбриональным антигеном приводит к выработке антител, не способных в диагностических тестах различать злокачественные и незлокачественные опухоли. Однако на поверхности раковоэмбрионального антигена находится специфическая антигенная детерминанта, отсутствующая на других антигенах. На основе этого было предложено применять двухцентровой моноклональный диаг-ностикум, где одно из антител было направлено к уникальной антигенной детерминанте и иммобилизовано, а другое антитело было помечено р-галактозидазой и использовано для выявления антигена в «сэндвич»-модификации анализа. С помощью диагности-кума должно обнаружить 0,5 мкг/л раковоэмбрионального антигена; кроме того, этот диагностикум обладает повышенной специфичностью.
Использование моноклональных антител, направленных к двум различным антигенным детерминантам на антигене («сэндвич»-мо-дификация иммуноанализа), позволяет сократить время анализа. При употреблении поликлональных антисывороток иммуноанализ
171
осуществляется в две стадии. Вначале к иммобилизованным на твердом носителе антителам добавляют антиген, инкубируют с ним, затем отмывают от ёго избытка и на второй стадии добавляют антитела, меченные ферментом. Такая последовательность связана с тем, что ферментный конъюгат, как правило, добавляют в значительном избытке по сравнению с концентрацией антигена и иммобилизованных антител. В этих условиях конъюгат конкурирует с иммобилизованными антителами за связывание с антигеном и искажает, а иногда и делает невозможным определение. Использование же пары неконкурирующих моноклональных антител, направленных к различным антигенным детерминантам, позволяет одновременно добавлять к иммобилизованным антителам анализируемый антиген и иммуноферментный конъюгат, что существенно сокращает время проведения анализа.
Отбор моноклональных антител по специфичности взаимодействия с антигеном. Для того чтобы оценить возможности моноклональных антител в иммуноанализе, необходимо в первую очередь выявить их способность перекрестно реагировать с другими соединениями. Поскольку процесс получения гибридом длителен и трудоемок, определение специфичности взаимодействия моноклональных антител с антигеном желательно проводить на как можно более ранних этапах после их получения.
Наиболее простым способом оценки специфичности моноклональных антител в процессе клонирования гибридом является метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с применением TSP-планшетов. TSP-планшеты представляют собой полисти-рольные стерильные крышки к 96-луночным культуральным платам, имеющие выступы, опускающиеся в лунки. Поверхность выступов TSP-планшетов может быть покрыта в стерильных условиях антигеном. Планшетом накрывают плату, в которой выращивают гибридомы таким образом, чтобы покрытые антигеном выступы опустились в среду культивирования гибридом. Выдерживают 1 ч и заменяют на новый планшет, выступы которого покрыты перекрестно реагирующим антигеном. Дальнейшую обработку TSP-крышек проводят в соответствии со стандартной методикой для непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Используя этот метод, можно в течение одного дня провести оценку способности моноклональных антител взаимодействовать с перекрестно реагирующими антигенами. Это дает возможность уже через 12—-15 дней отобрать и клонировать только те гибридомы, которые обладают нужной исследователю специфичностью.
