Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Достоинством гемина и других металлопорфиринов является их высокая стабильность по сравнению с ферментами. Надо отметить, что структурные особенности маркеров этого класса (высокая гидрофобность) создают определенные трудности при получении их конъюгатов с веществами небелкОвой природы — гормонами, лекарственными соединениями. Критерием возможности использования таких конъюгатов в анализе является сохранение антигенных свойств определяемого соединения, что удается достичь не во всех случаях.
Сравнительно недавно Кришка с соавторами (1983) опубликовали данные об открытии новой хемилюминесцентной реакции совместного окисления люминола и люциферина перекисью водорода, катализируемого пероксидазой. В этой системе обнаружен эффект усиления интенсивности хемилюминесценции в слабощелочных растворах (pH около 8,0). Незначительный уровень.фонового свечения в этих условиях и высокая интенсивность полезного сигнала позволяют детектировать в данной реакции до 5-10-18 молей пероксидазы. Изучение влияния ряда производных бензо-тиазола на интенсивность хемилюминесценции люмрнольной реакции пероксидазного окисления показало, что некоторые из них также реагируют как усилитель (табл. 4.8). Наибольшее практическое использование нашел эффект усиления в присутствии n-йодфенола. Применение в качестве второго субстрата л-йодфе-нола представляет большой практический интерес, связанный с
135
тем, что выше рассмотренные усилители (люциферин и родственные ему соединения) синтезируются по сложным методикам и их стоимость высока.
Таблица 4.8. Влияние производных беизотиазола на интенсивность хемилюминесценции в реакции лероксидазного окисления люминола Н202 (Thorpe G. Н. G. et al, 1985)
Соединение R r2 Интенсивность хемилюминесценции, мВ Усиление
1 Время, с
30 60 30 60
Производное бензотиазола н н 10 8 - -
2 н н он осн3 5950 13 7340 10 372 667
nh2 он 8 8 — —
NH., осн3 9 6 - -
ОН он 5 5 - -
С1 он 600 750 38 68
С1 осн3 3 2 — —
1 1 /СООН он* 7240 6990 453 636
/1 /СООН
<0 он** 2480 2460 155 224
<7] -СООН ОСН2СН3 5 4
S—
* синтетический люциферин ** светлячковый люциферин
Оптимизация условий проведения двухсубстратных реакций показала, что скорость реакции линейно зависит от концентрации люминола в диапазоне 10-6—10-5 М и достигает предельного значения при концентрации порядка 5,9-10-5 М. Для перекиси водорода область линейной зависимости от концентрации наблюдается
136
в диапазоне 10-5—10-3 М и предельное значение скорости реакции при концентрации выше 10-3 М. Использование концентраций перекиси, значительно превышающих насыщенную, не представляется целесообразным, так как в этом случае происходит возрастание фонового сигнала и, кроме того, увеличивается время, затрачиваемое на достижение максимальной интенсивности.
Зависимость скорости реакций от концентрации л-йодфенола и люциферина также имеет вид кривых с насыщением. Насыщающие концентрации составляют 5,0 -10~5 М в случае л-йодфенола и 6,0-10~5 М в случае люциферина. В системе индивидуального окисления люминола при слабощелочных условиях нижняя граница определения пероксидазы равна 10~10 М. Добавление люциферина (или я-йодфенола) позволяет снизить предел детекции фермента на два порядка.
• Таким образом, реакция окисления люминола перекисью водорода в присутствии второго субстрата позволяет определять фермент в очень низких концентрациях 10-12—5-10^13 М. Такая же чувствительность достигается и в спектрофотометрических методах анализа, но в случае спектрофотометрической детекции необходима инкубация субстрата с ферментом в течение довольно длительного времени (около 30 мин). Кроме того, отношение сигнала к фону на всем диапазоне калибровочной кривой равно 20—60, в то время как для спектрофотометрических методов оно не превышает 3—5. Это преимущество системы двухсубстратного окисления является основным, обеспечивающим эффективность ее использования в иммуноанализе. Не менее важное достоинство реакции двухсубстратного окисления — длительный диапазон стационарной скорости реакции (постоянство интенсивности излучения в течение 20—30 мин).
Кинетика светового излучения определяется главным образом чистотой используемых реагентов, т. е. зависит от наличия в препарате люминола примесей аминофталата. Предложены методики очистки, позволяющие получать препарат люминола с практически постоянным излучением в течение 20—30 мин. Значение этого факта для иммуноанализа трудно преувеличить. Постоянство сигнала во времени обеспечивает высокую точность, улучшает воспроизводимость результатов, значительно снижает требования к сопряжению действия дозирующих устройств и измерительной аппаратуры при работе в автоматическом режиме. В этом варианте метод ЛИФА (пероксидаза как маркер) является полностью альтернативным методу РИА.
На основе реакции двухсубстратного (люминол и люциферин) пероксидазного окисления разработаны твердофазные иммуномет-рические методы для определения антител к вирусу краснухи человека и конкурентный метод определения дигоксина. Чувствительность этих анализов была сопоставима с соответствующими вариантами фотометрических методов ИФА. Твердофазный метод
