Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 49

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 43 44 45 46 47 48 < 49 > 50 51 52 53 54 55 .. 115 >> Следующая

субстрат
АТР, NAD-зависимые биолюмииесцентные системы светляков или бактерий
В научной литературе имеется описание исследований возможности использования в качестве маркеров фосфокиназ — ферментов, катализирующих реакции с образованием АТР.
Рассмотрено три типа ферментативных реакций.
1. Пируваткиназы из мышц кролика:
фосфоенолпируват * пируват + АТР
Реакция протекает в присутствии Mg2+ и К+, рН-оптимум 7,0.
2. Ацетаткиназы (из Е. coli):
ацетилфосфат + ADP —*? ацетат + АТР
Для реакции необходим Mg2+ или Мп2+, рН-оптимум 7,4.
3. Аденилаткиназы (из мышц кролика):
ADP —” АТР + АМР
Реакция протекает в присутствии Mg2+, рН-оптимум 6,7.
Исследования показали, что конъюгаты на основе ацетаткиназы и аденилаткиназы практически полностью утрачивают ферментативную активность, в то время как пируваткиназа, ковалентно связанная с антителами, сохраняет каталитические свойства.
В качестве метки достаточно широко применяют глюкозо-6-фос-фатдегидрогеназу, катализирующую реакцию с образованием восстановленной формы кофактора — NADH. Использование для детекции NADH биолюминесцентной системы бактерий позволяет повысить предел обнаружения гаптена до 10~14 М. Описаны и более сложные полиферментные системы с многоступенчатой системой усиления сигнала (продукт первой реакции является субстратом для второй, продукт второй реакции — субстратом для третьей и т. д.). Примером такой системы может служить полиферментная система на основе галактозодегидрогеназы, р-галактозидазы и систем бактериальной люминесценции. Оптимизация условий протекания ферментативных реакций на каждой из стадий позволяет достигать значительного усиления сигнала.
131
Теоретически рассчитанная чувствительность такого метода очень высока, но практически всегда приходится сталкиваться с одновременным усилением не только полезного сигнала, но и фонового, обусловленного как химическим, так и иммунологическим шумом. Примеси кофакторов, дегидрогеназ в реагентах и образце, неспецифическое связывание конъюгата являются причиной достаточно высоких сигналов, часто нивелирующих преимущества систем с многократным усилением. В этом плане очень интересен вариант «туннельного» ЛИФА, когда антитела к определяемому соединению соиммобилизованы на носителе с FMN-оксидоредуктазой и бактериальной люциферазой. Маркером антигена в этом способе является глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, генерирующая NADH, который при связывании антигена с антителами прямо используется FMN-оксидоредуктазной системой фермента бактериальной люминесценции. NADH, выходящий в раствор, быстро окисляется без излучения света. Различие в скоростях реакций в растворе и на носителе позволило значительно снизить интерферирующее влияние дегидрогеназ сыворотки крови и проводить определение в 25 мкл плазмы. Метод использован для определения прогестерона, а-фетопротеина, хорионического гонадотропина человека и пролактина.
Несмотря на то что методы БИФА пока не нашли еще широкого практического распространения, они обладают рядом преимуществ, что говорит о перспективности их разработок.
• К основным преимуществам этих методов следует отнести высокую чувствительность и возможность разработки высокочувствительных гомогенных методов экспресс анализа.
Благодаря последним достижениям в области изучения структуры и функции ферментов, значительно снижены ограничения, обусловленные труднодоступностью и нестабильностью люцифераз. Получены препараты иммобилизованных биолюминес-центных систем, которые могут быть использованы в иммуноанализе, базирующемся на реакциях светляковой и бактериальной люцифераз.
Хемилюминесцентный иммуноанализ. Хемилюминесцентные реакции, подобно реакциям биолюминесценции, обладают высокой чувствительностью определения веществ, участвующих в реакции, что и обусловливает возможность их применения в качестве маркеров при разработке высокочувствительных методов иммуноанализа.
В литературе описано использование в иммуноанализе реакций окисления аминофталгидразидов (АФГ) в присутствии катализаторов, реакций перекисного окисления эфиров акридина, пероксидаз-ного окисления пирогаллола (ПР) и других полифенолов:
АФГ окис->штель аминофталат + hX (X = 425 нм)
катализатор
эфиры акридина На°* ^ метилакридон -f- hX (X = 470 нм)
ПР окис^-тель - продукты + hv {X = 480 нм)
132
Квантовые выходы в хемилюминесцентных реакциях ниже, чем в биолюминесцентных, однако чувствительность определения ве* ществ (субстратов и катализаторов) сравнима с биолюминесцент-ными системами, что обусловливается, прежде всего, наличием специфических для каждого метода фоновых реакций, накладывающих ограничения на его чувствительность.
Наиболее широко используемой в иммуноанализе хемилюми-несцентной реакцией является реакция окисления АФГ. При окислении АФГ образуется ион аминофталата, который при переходе в основное состояние излучает свет (Ятах=425 нм). Реакция окисления АФГ протекает как в органической, так и в водной среде. Для протекания реакции в органических растворителях (диметил-сульфоксиде, диметилформамиде) необходимы только основание и кислород, в то время как в водной среде окисление АФГ происходит в присутствии окислителя и катализатора.
Предыдущая << 1 .. 43 44 45 46 47 48 < 49 > 50 51 52 53 54 55 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed