Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 46

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 40 41 42 43 44 45 < 46 > 47 48 49 50 51 52 .. 115 >> Следующая

Наиболее высокочувствительными являются системы на основе реакций биолюминесценции, квантовый выход которых составляет 0,9, и реакций хемилюминесценции с квантовым выходом около
0,015. Оба типа реакций являются высокоэффективными каталитическими реакциями.
В аналитических работах измеряется либо значение пика световой интенсивности, либо интегральная характеристика свечения. При определенных условиях регистрируемая интенсивность свечения пропорциональна концентрации определяемого компонента реакции. Кроме того, люминесцентные реакции позволяют определять ряд соединений, участвующих в реакциях, сопряженных с люминесцентными системами.
9 Преимуществом люминесцентных систем является возможность регистрации интенсивности излучения в широком диапазоне значений, что соответствует большому интервалу концентраций определяемых веществ. Регистрация излучения производится с помощью фотоумножителей, кремниевых фотодиодов, фотопленок, что делает простым и доступным аппаратурное оформление люминесцентных методов.
124
Все указанные достоинства люминесцентных систем позволили рассматривать их как эффективную систему детекции в иммуно-химическом анализе. Соединение люминесцентного анализа с методами иммуноферментного анализа обеспечило быстрое развитие нового направления — люминесцентного иммуноанализа (ЛИА).
Методы ЛИА используют в качестве маркеров антигена или антитела вещества, участвующие в люминесцентной реакции (субстраты, кофакторы, катализаторы и ферменты). Общая схема ЛИА включает специфическую реакцию взаимодействия антиген — антитело, один из компонентов которой (Аг или Ат) ковалентно связан с маркером, детектируемым в люминесцентной реакции:
Ат + Аг — Л —у- Ат • Аг — Л -v hv,
где Ат — интитело; Аг — антиген; Л — люминесцентная метка.
Первые работы по люминесцентному иммуноанализу относятся к 70-м годам, когда была показана возможность использования люминесцентных маркеров для определения антигенов и антител. К настоящему времени в литературе описано большое количество различных модификаций ЛИА, многие из которых нашли практическое использование.
Методы ЛИА можно разделить на две большие группы, биолю-минесцентные и хемилюминесцентные, отличающиеся по типу реакции, используемой в качестве детектирующей системы.
Биолюминесцентный иммуноанализ. Перспективными в плане использования в иммуноанализе являются биолюминесцентные реакции, катализируемые люциферазами светляков и бактерий:
АТР + люциферин + 02 люцифераза светляков f ДДОР -f + оксилюциферин +2РР, -f- hv (560 нм)
NAD (Р) Н + Н+ + FMN оксиредуктаза _ NAD (Р) + + FMNH2 FMNH2 + 02 + RCHO люцифераза бактерий ; fMN + RCOOH -f-+ Н20 -f- hv (490 нм)
где RCHO и RCOOH — длинноцепочечный жирный альдегид и соответствующая кислота.
Важным свойством биолюминесцентных систем является их абсолютная специфичность по отношению к АТР (или NADH). Высокий квантовый выход этих реакций обеспечивает высокую чувствительность детекции ферментов и кофакторов —0,1 нмоль для АТР и 1 пмоль для NADH, и обусловливает возможность использования люминесцентных систем в качестве систем детекции антиген-антительных взаимодействий.
Молекулы кофакторов и ферментов, участвующих в биолюминесцентных реакциях (либо в реакциях, сопряженных с ними), могут быть модифицированы и ковалентно связаны с молекулой
125
антигена или антитела. По этому признаку методы биолюминесцент-ного иммуноанализа делятся на две группы — методы, использующие в качестве метки кофактор (люминесцентный иммунокофак-торный анализ, ЛИКА), и методы, основанные на ферментном маркере (люминесцентный иммуноферментный анализ, ЛИФА).
Таблица- 4.5. Люминесцентный иммунокофакторный анализ
Меченое Маркер Определяемое Детектирующая Предел
соединение соединение система обнаружения в пробе
Биотин-2,4- Производное Биотин-2,4- С2Н5ОН/алко-
ДНФБ NAD ДНФ гольдегидрогена-за -г- бактериальная люцифераза
2,4-ДНФБ Производное (2,4-ДНФ)-Р- Люциферин, лю- 0,5 нмоль
АТР аланин цифераза светляков 0,05 нмоль
Инсулин Производное АТР Инсулин То же 0,05 нмоль
Антитела к Производное Антитела к » 0,05 нмоль
инсулину АТР инсулину
Тироксин Производное Тироксин » ,1,0 нмоль
АТР
Миоглобин Производное АТР Миоглобин » 2,5 нмоль
Эстриол-16- Производное Эстриол-16- Глюкозо-6-фос- —
глюкоронид NAD глюкоронид фатдегидрогеназа, бактериальная люцифераза
Прогестерон Производное Прогестерон То же —
NAD
Люминесцентный иммунокофакторный анализ (ЛИКА). В методе ЛИКА используют в качестве маркеров антигенов молекулы кофакторов (АТР и NAD). Первые публикации по ЛИКА показали принципиальную возможность использования такого подхода для определения модельных антигенов — 2,4-динитрофениллизина (2,4-ДНФ-лизин) и биотина (табл. 4.5).
Метод основан на свойстве конъюгатов гаптена (антигена) с кофакторами (АТР и NAD) сохранять антигенную активность по отношению к антителам и коферментативную в реакциях с люци-феразами (светляков и бактерий). Антитела к гаптену при взаимодействии с конъюгатом стерически блокируют его, делая недоступным для взаимодействия с активным центром люциферазы, вследствие чего комплекс гаптен — кофактор — антитело утрачивает коферментативную активность. Концентрация образовавшегося комплекса может быть определена по снижению интенсивности излучения. Введение в эту систему свободного гаптена приводит к сдвигу
Предыдущая << 1 .. 40 41 42 43 44 45 < 46 > 47 48 49 50 51 52 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed