Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 45

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 39 40 41 42 43 44 < 45 > 46 47 48 49 50 51 .. 115 >> Следующая

Гомогенные методы, основанные на использовании меченых антител. Второй группой в гомогенном ИФА являются методы, основанные на использовании меченных молекулами ферментов антител. В противоположность первой, в которой все схемы относились к конкурентному типу, в данном случае анализ может быть и неконкурентным.
ИФА, основанный на ингибировании активности конъюгата антитело — фермент. Схема разработана на примере определения IgG человека и получила название EIIA (англ. enzyme inhibition immunoassay). Синтезируют конъюгат антител кролика против IgG человека с фосфолипазой С. Ферментативная активность конъюгата ингибируется при образовании иммунохимического комплекса с IgG человека. В качестве субстрата используют фосфолипиды, являющиеся компонентами мембран эритроцитов. Формально их можно рассматривать как низкомолекулярный субстрат, иммобилизованный на макроносителе. Причиной модуляции ферментативной активности конъюгата в комплексе с соответствующим антигеном является стерическое исключение субстрата. Увеличение концентрации анализируемого соединения в растворе сопровождается
122
возрастанием концентрации иммунохимического комплекса и снижением параметра, характеризующего каталитическую активность фермента.
ИФА, основанный на «усилении» ферментативной реакции. Метод разработан на примере определения IgG и С-реактивного белка и имеет в литературе аббревиатуру EEIA (англ. enzyme enhancement immunoassay). Используют меченные р-галактозидазой антитела против определяемого поливалентного антигена и антитела той же специфичности, обработанные янтарным ангидридом (сук-цинилированные антитела). Субстратом р-галактозидазы является
о-нитрофенил-р-галактозид, ковалентно связанный с высокомолекулярным декстраном. В присутствии определяемого белка, вследствие образования иммунохимических комплексов ограниченного числа меченых и избытка сукцинированных антител с поливалентным антигеном, фермент, находясь в области микроокружения с отрицательным зарядом, образует вторую светорассеивающую среду, в то время как в отсутствие комплекса продукт ферментативной реакции остается растворимым. За протеканием ферментативной реакции следят фотометрически по увеличению мутности раствора.
О В заключение раздела отметим, что гомогенный ИФА является перспективной и быстро развивающейся областью анализа, имеющей много различных подходов для его проведения. Основным достоинством этого направления является возможность экспресс-анализа биологически активных соединений.
Иммуноферментные наборы, основанные на принципе EMIT, в настоящее время являются наиболее эффективным средством для быстрого определения наркотиков и лекарственных соединений. Если ранее широкое применение гомогенного ИФА сдерживалось возможностью определения только низкомолекулярных антигенов, то разработанные в последние годы подходы позволяют проводить быстрый количественный анализ макромолекулярных белковых антигенов и антител. К ограничениям применения гомогенных методов следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (исключением являются системы с биолюминесцентной детекцией), и сложность анализа биологических сред, содержащих в значительной концентрации эффекторы или кофакторы фермента.
§ 8. Люминесцентный иммуноанализ
В последние годы интенсивное развитие получили методы люминесцентного иммуноанализа (ЛИА), основанные на использовании в качестве меток антигенов и антител компонентов реакций хеми- и биолюминесценции (в том числе ферментативных), протекающих с излучением света. Интенсивность испускаемого света может быть зарегистрирована с высокой сте-
123
пенью чувствительности, что позволяет проводить определение метки в чрезвычайно низких концентрациях и, следовательно, разрабатывать на их основе высокочувствительные иммунохимические методы анализа. В связи с быстрым развитием данного направления в иммуноанализе и перспективами его практического использования целесообразно посвятить его рассмотрению специальный раздел. В отличие от флуоресцентных методов при проведении люминесцентных методов не требуется дополнительного источника возбуждения, из-за чего существенно упрощается постановка эксперимента и устраняется фоновое рассеяние.
Реакции хеми- и биолюминесценции являются окислительно-восстановительными реакциями, механизм которых сложен и для большинства систем недостаточно изучен. В процессе реакции образуется большое количество нестабильных короткоживущих продуктов, одним из которых является продукт, находящийся в электронно-возбужденном состоянии. Переход этого продукта в основное состояние сопровождается излучением видимого света. Квантовый выход люминесцентных систем определяется эффективностью образования электронно-возбужденного продукта и квантовым выходом его флуоресценции. Значение его измеряется отношением количества излученных фотонов к количеству прореагировавших молекул исходных соединений.
Интенсивность излучаемого света, являющаяся основным регистрируемым параметром, пропорциональна скорости реакции и квантовому выходу люминесценции. Вследствие этого наибольшую чувствительность обеспечивает применение в анализе реакций с высоким квантовым выходом и высокой скоростью протекания, которая достигается с помощью катализаторов.
Предыдущая << 1 .. 39 40 41 42 43 44 < 45 > 46 47 48 49 50 51 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed