Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
ИФА, основанный на использовании в качестве метки эффектора фермента'. В зарубежной литературе метод получил сокращенное название EMMIA (англ. enzyme modulator mediated immunoassay). Принцип его основан на способности связанного с антигеном модулятора (активатора или ингибитора) влиять на активность фермента в растворе. Конъюгат эффектора и антигена конкурирует с определяемым антигеном в растворе за связывание с антителами. При комплексообразовании с антителами эффектор в конъюгате теряет способность влиять на каталитическую активность индикаторного фермента. Поэтому увеличение в растворе концентрации определяемого антигена приводит к увеличению содержания свободного, не связанного в комплекс с антителами
119
конъюгата антиген — эффектор и, следовательно, к изменению регистрируемой ферментативной активности. Схема метода:
конъюгат
антиген-эффектор
ИФА, основанный на использовании в качестве метки простеги-ческой группы. В зарубежной литеоатуре метод встречается под аббревиатурой PGLIA (англ. prosthetic group labelled inmmuno-asay). Получают ковалентный конъюгат определяемого антигена с простетической группой — флавинадениндинуклеотидом (FAD). Такой конъюгат в свободном состоянии способен взаимодействовать с апоферментом (неактивной глюкозооксидазой, лишенной простетической группы), что приводит к образованию каталитически активной нативной формы фермента. Комплексообразование конъюгата с антителами против антигена вследствие стерических затруднений препятствует реконструкции каталитически активного холофермента. Присутствие в такой системе анализируемого антигена смещает равновесие в сторону образования свободного конъюгата, что приводит к увеличению регистрируемого параметра ферментативной реакции. Схема метода:
На основе данного подхода было осуществлено определение
120
низко- и высокомолекулярных антигенов, таких, как теофиллин, фенитоин, иммуноглобулин G человека.
ИФА, основанный на использовании в качестве метки субстрата, превращающегося в флуоресцентный продукт. В методе, получившем в литературе название SLFIA (англ. substrate labelled fluorescent immunoassay), используют меченный нефлуоресцентным субстратом антиген, способный ферментативно превращаться в продукт, обладающий сильными флуоресцентными свойствами. При связывании конъюгата с антителами против определяемого антигена субстрат становится недоступным ферменту и образования флуоресцирующего продукта в системе не происходит. При повышении в растворе концентрации определяемого антигена равновесие между компонентами сдвигается в сторону накопления свободного конъюгата субстрат—антиген, что приводит к увеличению наблюдаемой флуоресценции. Схема метода:
Таким образом, в данной системе конъюгат выступает в роли как аналога антигена, способного эффективно конкурировать за центры связывания антител, так и субстрата фермента. Очевидно, что концентрация определяемого этим способом антигена должна быть сравнима с концентрацией конъюгата в растворе, поэтому чувствительность анализа в данном случае невелика и лежит в микромолярной области концентраций. Метод был использован для определения ряда лекарственных соединений, иммуноглобулинов G и М человека.
ИФА, основанный на использовании в качестве метки электронного медиатора. На примере определения тироксина предложен гомогенный метод, основанный на способности иммунохимически активного конъюгата тироксина с производным ферроцена функционировать в качестве медиатора электронного переноса между оксидоредуктазным ферментом и электродом. При связывании с антителами против тироксина конъюгат утрачивает медиаторные свойства. Для проведения анализа инкубируют анализируемую
db© >-/ + ^
+ (А^) + F.I
неактивен как субстрат
неактивен
активен как субстрат
121
пробу с конъюгатом и антителами, после чего вносят в раствор глюкозооксидазу и глюкозу и измеряют активность фермента с помощью электрохимического датчика.
Анализ с использованием липосом. В рассмотренных ранее методах фермент является меткой, перераспределение которой в ходе анализа зависит от концентрации определяемого соединения. Новым направлением ИФА являются системы, основанные на том, что появление фермента в растворе есть следствие специфического взаимодействия антиген — антитело.
Один из путей создания таких систем — заключение фермента внутрь липосом, на внешней поверхности которых иммобилизован антиген. Если в такую систему добавить субстрат, то он не превращается ферментом, так как разделен с ним стенками липосомы. При добавлении в систему специфических антител и комплемента на поверхности липосомы образуется комплекс антиген — антитело — комплемент, который лизирует ее стенки, вследствие чего фермент переходит во внешний раствор. Добавление определяемого антигена ингибирует процесс лизиса из-за присоединения к липо-соме меньшего количества молекул антител и комплемента. Измеряемая скорость ферментативной реакции служит характеристикой начальной концентрации антигена.
Данный подход в принципе позволяет проводить количественное определение как антигенов, так и антител. Длительность анализа невелика; так, время определения алкалоида теофиллина с использованием липосом с пероксидазой составило 15 мин при пределе обнаружения 4-10~9 М. Метод приведен в данном разделе, так как антиген связан с липосомой, которую формально можно рассматривать как неферментную метку.
