Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
На практике данный подход был реализован на примере многих низкомолекулярных антигенов и других ферментов — малатдегид-рогеназы печени свиньи и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, и также известен под названием «ЕМ1Т». Используют конъюгаты ферментов с гаптенами, которые незначительно отличаются по активности от нативного фермента. При взаимодействии с антителами против гаптена в молекуле фермента происходят конформационные изменения, затрагивающие структуру активного центра, в результате чего ферментативная активность сильно падает. Введение в реакционную систему свободного антигена приводит к уменьшению концентрации комплексов конъюгат — антитело, а следовательно, измеряемая активность при увеличении концентрации анализируемого соединения также возрастает.
Схема метода аналогична случаю с исключением субстрата, только механизм изменения каталитической активности в иммуно-химическом комплексе с конъюгатом имеет другую природу.
Для некоторых гаптенов (тироксин и трийодтиронин) оказалось, что их ковалентное связывание с ферментом приводит к полному падению его каталитической активности, обусловленному относительной подвижностью находящегося в непосредственной близости от активного центра фермента гаптена и возможным ингибирующим его действием на связывание субстрата. В свободном состоянии конъюгат неактивен, но его связывание с антителами приводит к реактивации фермента и степень реактивации однозначно связана с концентрацией определяемого гаптена в растворе.
На основе EMIT-анализ-а разработаны коммерческие наборы для определения широкого круга лекарственных соединений в сыворотке крови—дигоксина, теофиллина, метотрексата, тиобрамици-на и др. Для анализа обычно требуется менее 50 мкл сыворотки, время определения 15—45 с.
ИФА, основанный на использовании антител против активного центра фермента. При использовании сывороточного альбумина человека как модельного антигена разработан гомогенный ИФА, основанный на конкурентном связывании с конъюгатом фермент — антиген двух типов антител: специфических антител против определяемого антигена и антител против фермента, вызывающих при связывании полную потерю его каталитической активности. Вследствие стерических затруднений связывание с конъюгатом антител против антигена приводит к потере способности взаимодействия антител второй специфичности с ферментом. В присутствии определяемого антигена доля специфических антител, Связанных с конъю-
117
гатом, уменьшается, что приводит к возрастанию концентрации ферментативно неактивных комплексов конъюгата с антителами против фермента и снижению экспериментально регистрируемого сигнала. Ниже приведена схема метода:
Были синтезированы конъюгаты сывороточного альбумина человека с аденозиндезаминазой ?— ферментом, катализирующим гидролиз аденозина с образованием инозина и аммиака. Для регистрации ферментативной активности использовали чувствительный к аммиаку ионселективный электрод. Метод прост и. позволяет определить белок в концентрации ~ 1 мкг/мл.
ИФА, основанный на эффекте ингибирования субстратом фермента-метки. В качестве метки антигена используют пероксидазу хрена. Принцип метода основан на значительном отличии ферментативной активности исходного конъюгата и конъюгата в комплексе со специфическими антителами при детекции метки в присутствии 35 мМ перекиси водорода, которая является субстратом пероксидазы. Пероксидаза нативная и в конъюгате с антигеном в значительной степени ингибируется уже при концентрации перекиси 10 мМ, но сохраняет активность в конъюгате при связывании с соответствующими антителами. Новый подход апробирован на примере а-фетопротеина, ферритипа, рг-микроглобулипа, дигокси-на, иммуноглобулина Е. При длительности 20—30 мин метод позволяет определять до 10 нг/мл а-фетопротеина, что сопоставимо с чувствительностью гетерогенного ИФА.
Методы ИФА антигенов, основанные на использовании неферментных меток. Иммунокофакторный анализ. Среди этой группы гомогенных методов наиболее известны варианты с применением в качестве метки АТР и NAD. Суть обоих подходов заключается в следующем. Синтезируют ковалентные конъюгаты АТР и NAD с определяемым антигеном. Получаемые конъюгаты сохраняют свои коферментативные свойства в реакциях с участием соответствующих ферментов. В присутствии антител против определяемого антигена конъюгаты, образуя специфический комплекс с анти-118
>-
активным
центр
фермента
- антитела против определяемого антигена и фермента-метки.
телами, теряют свои коферментативные свойства, очевидно, вследствие стерического экранирования объемной молекулой антитела молекулы кофактора, который уже не может взаимодействовать с активным центром фермента. При увеличении концентрации определяемого антигена в растворе доля свободного конъюгата возрастает, что приводит к увеличению регистрируемого параметра ферментативной реакции. Схема метода:
активен неактивен
как кофактор
где — кофактор; Е, S, Р - фермент, субстрат и продукт реакции.
В случае метки АТР в качестве фермента используют люцифе-разу светляков. За активностью следят по реакции биолюминес-денции, регистрируя возникающее в процессе ферментативной реакции свечение. Метод был применен для анализа ряда модельных соединений, в том числе инсулина. Достоинствами метода являются экспрессность и высокая чувствительность, обусловленная возможностью люминесцентной регистрации метки в крайне низких концентрациях. В случае метки NAD для определения концентрации не связанного в комплекс с антителами конъюгата используют двух- или одноферментную систему регенерации кофактора, позволяющую регистрировать метку в концентрации до 10~ro М. Метод так же, как и предыдущий, позволяет осуществлять анализ в течение нескольких минут, однако имеет более низкую чувствительность.
