Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 41

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 35 36 37 38 39 40 < 41 > 42 43 44 45 46 47 .. 115 >> Следующая

Перспективный метод ИФА основан на применении антител, иммобилизованных на водорастворимом полимере. Принцип анализа состоит в следующем. К раствору иммобилизованных на полианионе антител добавляют определяемый и меченный ферментом антиген и проводят реакцию конкурентного связывания. Для разделения свободного и связавшегося в комплексе конъюгата вносят поликатион, который быстро и количественно образует с полианионом нерастворимый поликомплекс. После разделения жидкой и твердой фаз регистрируемая в надосадочном растворе или осадке ферментативная активность дает информацию о начальной концентрации исследуемого антигена. Для удобства измерения активности полученный осадок может быть вновь легко растворен при увеличении ионной силы.
• Достоинствами данной модификации ИФА являются: 1) отсутствие твердой фазы; 2) быстрота разделения компонентов реакционной системы (I тип); 3) экспрессность при сохранении высокой чувствительности (время определения IgG человека в концентрации 10"10 М не превышает 10 мин); 4) возможность быстрого анализа антигенов с различной молекулярной массой. К основным недостаткам, снижающим универсальность метода, относятся возможность неспецифической сорбции соединений на полианионе или поликатионе и необходимость стадии промывки нерастворимого поликомплекса при определении ферментативной активности в осадке.
Маттиассон с сотрудниками предложили новый путь разделения компонентов при проведении иммуноанализа, не сопровождающийся изменением агрегатного состояния системы. Суть метода
112
состоит в создании на стадии разделения связанного в иммунокомплексе и свободного компонента быстро расслаивающихся жидких двухфазных систем. При этом в одной фазе концентрируется несвязанный с антителами меченый антиген, а в другой — комплекс меченого антигена с антителами.
Количественной мерой в данном методе является коэффициент разделения компонентов, равный отношению концентраций меченого соединения в верхней и нижней фазах. В ряде случаев эффективность разделения может быть существенно увеличена при использовании связывающего агента (антитело, лектин, белок А стафилококка), предварительно модифицированного монометоксипо-лиэтиленгликолем. Метод может быть применен для анализа гаптенов, макромолекулярных антигенов и целых клеток.
• Достоинством является экспрессность и возможность определения различных по молекулярной массе и природе антигенов. Основной недостаток заключается в необходимости индивидуального выбора оптимальных условий разделения для каждой пары лиганд-связывающий агент и предварительной модификации компонентов для увеличения эффективности перераспределения веществ в разных фазах.
В последние годы появился ряд гетерогенных методов ИФА, в которых не требуется проведения стадии разделения свободных и связанных в иммунохимический комплекс меченых соединений. Иногда в литературе такие подходы не вполне корректно относят к гомогенным методам, хотя все они основаны на использовании твердой фазы и иммобилизованных на ней компонентов. Правильнее их называть безразделительными методами (англ. non separation assay).
Рассмотрим один из подходов, получивших в зарубежной литературе сокращенное название ECIA (англ. enzyme channeling immunoassay), т. е. «туннельный» иммуноферментный анализ. Его принцип основан на ускорении протекания двух последовательных ферментативных реакций при пространственном сближении двух ферментов (Ej и Ё2). При этом Е2 катализирует реакцию с участием субстрата, являющегося продуктом первой ферментативной реакции. Определяемый антиген ковалентно связывают с ферментом Еь Этот конъюгат конкурирует за ограниченное число центров связывания антител, иммобилизованных на твердом носителе совместно со вторым ферментом Е2. Общая наблюдаемая скорость появления в растворе второго продукта Р2 зависит от концентрации свободного антигена в системе. При ее увеличении в растворе количество конъюгата, сорбированного на носителе, уменьшается, что приводит к уменьшению регистрируемой скорости появления продукта Р2. Для уменьшения фонового сигнала в растворе в отсутствие определяемого антигена в систему добавляют третий фермент Е3, который играет роль «ловушки» продукта Pi в растворе, превращая его в неактивный продукт Q:
113
На этом принципе основан биолюминесцентный ИФА прогестерона, позволяющий выявлять до 10 пг гормона в пробе.
• В заключение раздела еще раз подчеркнем, что основными достоинствами гетерогенных методов ИФА является высокая чувствительность, возможность определения соединений с различной молекулярной массой (от гаптенов до целых клеток), возможность анализа образцов, содержащих ингибиторы и активаторы фермента-маркера. Развивающиеся в настоящее время кинетические методы твердофазного ИФА, а также ИФА на основе водорастворимых полимеров открывают возможность «экспресс»-анализа исследуемых веществ.
Оценивая состояние проблемы на сегодняшний день, следует отметить, что гетерогенные методы ИФА активно используются в иммунохимическом анализе, а появление новых, усовершенствованных модификаций свидетельствует о том, что интерес к этому направлению в ближайшие годы будет возрастать.
Предыдущая << 1 .. 35 36 37 38 39 40 < 41 > 42 43 44 45 46 47 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed