Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
105
l-o >-
|-o>-j-o ? l-o>-
a
r°>-
й , \ 2) отмывка
|-U + >--? -o-
Недостатками метода являются многостадийность, необходимость предварительной модификации как антител, так и фермента и наличие достаточно высокого уровня неспецифического связывания у молекулы авидина, так как, являясь по своей природе гликопротеидом, этот белок имеет высокую изоэлектрическую точку и способен к комплексообразованию с другими белками. Последний из недостатков может быть устранен использованием в качестве специфического к биотину белка не авидина, а стрептавидина. Молекула стрептавидина обладает также четырьмя высокоаффинными центрами связывания биотина, но имеет изоэлектрическую точку, близкую к нейтральной, и в меньшей степени склонна к неспецифическому связыванию с антителами.
• Еще один метод нековалентного введения ферментной метки основан на применении конъюгатов антител с лектинами — растительными белками, способными специфически связываться с углеводными остатками, входящими в состав биомолекул. В связи с этим лектины применяются для очистки и выделения гликопротеидов.
Одним из широко используемых для этой цели лектином является конканавалин А из бобов конавалии (Л1г=96 000). Ковалентный конъюгат антител с лектином получают с помощью глутарового альдегида. Выделенные конъюгаты могут использоваться для определения антигенов и антител. Одна из возможных схем проведения ИФА антител на основе конъюгата фермента с лектином имеет вид
2) отмывка
107
iE)
7) определение ферментативной активности
где —^ — лектин, — фермент, содержащий углеводный компонент
Исследуемые антитела взаимодействуют с иммобилизованным антигеном. После промывки добавляют конъюгат антивидовых антител с лектином в присутствий избытка специфического для лекти-на углевода (например, метил-р-О-маннозида в случае конканава-лина А) для предотвращения связывания лектина с углеводным компонентом антител и иммобилизованного антигена.
После инкубации отмывают избыток конъюгата и углевода и добавляют фермент, имеющий углеводную часть, способную специфически взаимодействовать с лектином (например, пероксида-зу хрена, глюкозооксидазу из Aspergillus niger). На последней стадии определяется концентрация метки на твердой фазе, которая пропорциональна исходной концентрации исследуемых антител.
Необходимо отметить, что отсутствие углеводного компонента на молекуле фермента-метки не является непреодолимым препятствием для применения этого фермента в анализе на основе лектина. Так, авторами метода была показана возможность использования Р-/)-галактозидазы, у которой отсутствует углеводный компонент, предварительно ковалентно связанной через глутаровый альдегид с глюкозооксидазой, способной взаимодействовать с лектином. Такой подход, конечно, приводит к усложнению анализа, но вместе с тем позволяет использовать ферменты, обладающие высокой каталитической активностью, что повышает чувствительность определения.
108
§ 5. Твердофазный ИФА в проточных системах
Решение ряда задач, стоящих перед медициной и биотехнологией, требует развития методов «экспресса-определения биологических соединений. В связи с этим актуальной проблемой является максимальное сокращение длительности анализа. В рассмотренных методах ИФА длительность всего анализа в основном определяется временем проведения одной или нескольких последовательных иммунохимических реакций. Известно, что максимальная чувствительность анализа достигается при проведении стадии взаимодействия определенного вещества с соответствующими специфическими центрами связывания в равновесном режиме. При переходе в кинетическую область время анализа существенно снижается, но при этом происходит и потеря чувствительности.
Однако при анализе соединений, находящихся в исследуемой пробе в концентрациях, значительно превышающих предел его обнаружения, длительность ИФА можно существенно уменьшить за счет проведения иммунологической и ферментативной реакций в кинетических режимах, сокращая время контакта компонентов с часов до нескольких минут.
Методически такой анализ наиболее удобно проводить в проточных реакторах, время контакта компонентов в которых регулируется скоростью потока. Одним из вариантов такого анализа является следующий. Через колонку с иммуносорбентом в течение 1 мин прокачивают смесь меченного ферментом и анализируемого антигенов, которые конкурируют за центры связывания иммобилизованных антител. Затем колонку промывают, пропускают субстрат и измеряют на выходе оптическую плотность продукта ферментативной реакции, которая пропорциональна концентрации определяемого антигена:
Полный цикл определения составляет 10 мин. После удаления связавшегося свободного и меченого антигена действием pH, растворов солей или этанола колонка с иммуносорбентом может вновь использоваться для анализа.
Необходимым условием для получения воспроизводимых результатов анализа в кинетическом режиме является постоянство таких параметров, как время контакта реагентов, температура, объем анализируемой пробы.
В этой связи весьма перспективно сочетание принципов ИФА и проточного инжекционного анализа. Один из возможных вариантов основан на применении анализа с вытеснением связанного в комплекс с иммобилизованным антителом меченного пероксидазой антигена.
