Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
• Следует отметить, что с иммобилизованным антигеном могут связываться не только свободные меченые антитела, но и антитела, провзаимодействовавшие с определенным антигеном только одним активным центром. Вероятность такого взаимодействия возрастает с уменьшением размеров антигена, что следует учитывать при определении конкретных соединений. Разделение компонентов на иммуносорбенте целесообразно проводить в кинетическом режиме, поэтому эта стадия не лимитирует время анализа в целом. Недостатком метода является контакт ферментной метки с анализируемым образцом, что может вызвать изменение ферментативной активности.
Метод с использованием меченых вторичных антител и иммобилизованного антигена. Метод также является гомогенно-гетерогенным и имеет сходные черты с вышеописанным иммуноферментомет-рическим анализом. Отличие его заключается в том, что на первой стадии используют немеченые специфические антитела, а образующийся на твердой фазе комплекс выявляют с использованием меченых вторичных антител. Схема метода:
93
о
о
>-
>-
1) инкубация
о>-
ОУ~
2) инкубация
• Метод более длителен в проведении по сравнению с предыдущим, однако в нем исключается контакт исследуемой жидкости с ферментной меткой и можно использовать один и тот же антивидо-вой конъюгат для анализа различных антигенов.
Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованных антител (последовательного насыщения). Так как на первой стадии используется твердая фаза с иммобилизованными антителами, метод относится к твердофазным. Схема метода:
о
о
о
1) инкубация
40
Ко о
§-<о о~®
f-<OOH>
1ч о-©
2) отмывка
|
3) инкубация ^ = 1
140
40
Но-©
Он)
4) отмывка
О-® ~
94
40
40
ЧСХН)
5) определение ферментативной активности
Иммобилизованные антитела инкубируют с раствором, содержащим определяемый антиген. После отмывки к носителю добавляют меченный ферментом антиген, который взаимодействует со свободными антигенсвязывающими центрами антител.
• Длительность всего анализа обусловлена в основном временем первой стадии, которую целесообразно проводить в равновесном режиме. Метод позволяет предотвратить влияние биологической жидкости на активность фермента, так как вторая реакция проводится после отмывки иммуносорбента.
К носителю с иммобилизованным антигеном добавляют раствор определяемого антигена и раствор, содержащий фиксированное количество меченных ферментом специфических антител. После инкубации и отмывки несвязавшихся с носителем компонентов определяют ферментативную активность на носителе. Метод является твердофазным, так как носитель с иммобилизованным антигеном используют на первой стадии анализа, включает лишь одну равновесную стадию инкубации, поэтому время анализа определяется в основном продолжительностью этой стадии, однако не дает возможности избежать контакта фермента-маркера с анализируемой средой. В связи с этим ограничения его применения могут возникать при необходимости анализа биологических жидкостей (сыворотка
Конкурентные методы
Метод с использованием меченых антител и иммобилизованного антигена. Схема метода:
2) отмывка
95
крови, сок растения, экстракты тканей и т. д.), способных оказывать ингибирующее или активирующее воздействие на фермент или содержащих эндогенный фермент.
Так как определяемый антиген приводит к снижению количества сорбированных на носителе меченных ферментом антител, что вызывает уменьшение регистрируемой ферментативной активности, в литературе данная схема иногда встречается под названием «ингибиторный ИФА».
Метод с использованием меченых вторичных антител и иммобилизованного антигена. Схема метода:
Метод также является твердофазным и формально имеет сходные черты с вышеописанным «ингибиторным» анализом. Отличие заключается в том, что на первой стадии используют немеченые специфические антитела, а для выявления образующихся на носителе специфических иммунохимических комплексов вводят в него ферментативную метку с помощью реакции с меченными ферментом вторичными антителами.
Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованных антител. Схема метода:
5) определение ферментативной активности
96
2) отмывка
К иммобилизованным на носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена. Максимальная чувствительность достигается при проведении анализа в равновесном режиме. При проведении анализа следует стремиться к уменьшению концентрации иммобилизованных антител до значений, позволяющих достоверно регистрировать связавшийся с ними меченый антиген.
• Преимуществом метода является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ, а к недостаткам следует отнести сложность и неуниверсальность методов синтеза ферментных конъюгатов, особенно в случае низкомолекулярных антигенов, возможность ухудшения эффективности взаимодействия меченых антигенов с соответствующим# антителами и, наконец, возможное влияние на ферментативную активность компонентов анализируемой биологической жидкости.
