Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
85
Таблица 4.2. Гетерогенные методы ИФА антител,
основанные на определении специфических иммунных комплексов (тип I)
Неконкурентные Конкурентные
Меченый реагент Иммобилизованный реагент твердо- фазные гомогенно- гетерогенные твердо- фазные гомоген-но-гетерогенные
Специфическое Антиген ^—(^)
>-чэ Антитело |^
Антитела Антивидовое антитело ^
Антивидовое Антиген Есть
Антитело ^^
Антивидовое антителе |^
Антыгеи | Вть
Антиген О--® Антитело
Антивидовое антитело | Ecti. 1 1 ......\______ .. ...
Таблица 4.3. Гетерогенные методы ИФА антигенов,
основанные на определении оставшихся свободными центров специфического связывания (тип II)
Меченый реагент Иммобилизованный реагент Неконкурентные Конкурентные
твердо- фазные гомоген- но-гете- рогенные твердо- фазные гомоген- но-гете- рогенные
Антитела Специфическое антитело У~® Антиген ^—(^) Есть Есть
Антитело ^
Антивидовое антитело Ц—^
Антивидовое антитело Антиген |
Антитело ^
Антивидовое антитело ||—
Антиген 0-0 Антиген Ц—(^)
Антитело ||—^
Антивидовое антитело ^^
86
мере, две антигенные детерминанты, а для анализа большого числа моновалентных антигенов (например, стероидные гормоны, лекарственные соединения, пестициды) он неприемлем.
• Данная схема проведения анализа требует затраты большого времени, так как состоит из нескольких последовательных операций, однако обладает рядом существенных достоинств, обусловли-
Таблица 4.4. Гетерогенные методы ИФА антител,
основанные на определении оставшихся >незанятыми мест специфического связывания (тип II)
Меченый реагент Иммобилизованный реагент Неконкурентные Конкурентные
твердо- фазные гомогенно-гетерогенные твердо- фазные гомоген- но-гете- рогеииые
Антитела Специфическое антитело >ЧЕ) Антиген U—(^) Есть Есть
Антитело
Антивидовое антнтело Ц—
Антивидовое антитело >ЧЕ) Антиген Ц—?) Есть Есть
Антитело ||—
Антивидовое антитело ||—^
Антигец —(х) Антигеи ||—
Антитело Есгь Есгь
Антивидовое антнтело ||—^
вающих ее широкое применение. Основным из них является высокая чувствительность метода, превышающая возможности других схем ИФА. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от равновесной константы связывания реакции антиген — антитело и концентрации компонентов. При данной константе связывания, характеризующей используемые в конкретном эксперименте антитела, и при крайне низких концентрациях антигена рассматриваемый метод дает возможность сдвигать равновесие в сторону образования специфических комплексов за счет использования избытка (по сравнению с концентрацией антигена) иммобилизованных и меченных ферментом антител.
Максимальная чувствительность достигается при проведении Каждой иммунологической реакции в равновесном режиме, что и определяет длительность анализа, которая в среднем составляет 4—6 ч. Если не учитывать возможность неспецифических взаимодействий на стадии выявления специфических иммунокомплексов с помощью ферментного конъюгата, то предел обнаружения антиге-
87
нов данным методом зависит от чувствительности регистрации ферментной метки на носителе. При использовании высокочувствительных систем детекции ферментативной активности предел обнаружения соединений данным методом в настоящее время достигает величины порядка 10-21 моль, что соответствует обнаружению в образце всего 600 молекул анализируемого соединения.
• Так как перед стадией регистрации ферментативной активности проводят отмывку носителя от компонентов исследуемых жидкостей, то метод исключает влияние на ферментативную активность и, следовательно, на результаты анализа присутствующих в анализируемой пробе эффекторов.
«Сэндвич»-метод методически упрощается, если анализируемый антиген и меченые антитела добавлять к иммуносорбенту одновременно. Схема метода:
-<
активности
О >-€>
О >-©. 1) инкубация ^
о+ >-© ' о >-©
3) определение ^ ферментативной
Иэ>-©
ЧО>-<н> ОУ~®
!~ко у-®+ у-® о
2) отмывка
Иногда в литературе эта схема называется одностадийным «сэндвич»-анализом. Как и в предыдущем случае, на носителе образуется тройной комплекс с участием меченых антител, концентрация которого пропорциональна начальной концентрации определяемого антигена.
Однако чувствительность одностадийной схемы ниже, чем двухстадийной, а контакт фермента с анализируемой средой может неблагоприятно отражаться на результатах анализа. Данная схема налагает также дополнительные требования на соотношение концентраций меченых и иммобилизованных антител с целью исключения их конкуренции за связывание с ограниченным числом антигенных детерминант на молекуле антигена. В этой связи целесообразным является использование в анализе моноклональных антител, специфичных к различным антигенным детерминантам на мчлекуле антигена. Следует подчеркнуть, что данный метод анализа не может быть отнесен к конкурентному типу, так как формирование комплекса антигена с мечеными или иммобилизованными антителами не
