Иммунология. Том 2 - Дэвид Г.
ISBN 5-03-000497-1
Скачать (прямая ссылка):
14.2.6. Гены, кодирующие антигены класса I [27—41] ;
Технология, основанная на использовании рекомбинантной ДНК, явилась новым могучим орудием при исследовании мультигенных семейств, таких, \ как МНС. Использование клонированных сегментов ДНК, кодирующих анти- I гены МНС, позволит разрабатывать фундаментальные проблемы, неразреши- f мые в рамках серологической и структурно-биохимической методологии, такие, f например, как определение числа генов МНС, особенности их организации ; и экспрессии. Кроме того, возможность реэкспрессии клонированных генов \ в новых клетках-хозяевах открывает перспективы функционального изучения ^ индивидуальных MHC-продуктов на качественно новом уровне. г
14.2.6.1. Подходы к изучению генов класса I j
Первые работы по изучению генов класса I включали в себя выделение | мРНК из клеток, образующих соответствующий антиген, и различные процеду- | ры фракционирования РНК для получения обогащенной фракции, ответствен- I ной за синтез конкретных молекул класса I. Разделение контролировали, осу- | ществляя трансляцию мРНК в системах бесклеточного синтеза белка и опреде- { ляя искомый белок в смеси продуктов трансляции. Препарат, в достаточной степени обогащенный определенной мРНК, использовали для синтеза кДНК, ; которую встраивали в плазмиды и размножали в бактерии Escherichia coli. ’ Имея библиотеку таких клонированных сегментов к ДНК, можно затем прово- | дить их скрининг по способности гибридизоваться с мРНК, ответственной ; за синтез антигена МНС. Скрининг может быть основан на ингибировании трансляции или на положительной селекции мРНК с помощью клонов кДНК. После выявления соответствующего клона встроенную ДНК «вырезают» из плазмиды и определяют ее последовательность. Последовательность ДНК в пределах такого сегмента должна соответствовать заранее известной белковой ; последовательности продукта.
Получение необходимого кДНК-зонда, основанное на использовании мРНК в синтетической системе, — утомительная, многоэтапная работа, в ходе которой ! всегда существует опасность потерять высоколабильную мРНК. При этом возникают и дополнительные проблемы, включающие, например, получение ! соответствующих антител для преципитации синтетического продукта из системы бесклеточной трансляции. Как правило, аллоиммунные сыворотки не подходят для этой цели; наиболее удобными оказались гетероантисыворотки, ‘ которые могут реагировать со свободными цепями. Такие антисыворотки, однако, нередко реагируют с детерминантами, общими для нескольких антигенов. Поэтому остается неясным, какой антиген или антигены класса I будут содержаться в преципитате. Эти трудоемкие процессы можно обойти, если получить ДНК-зонд, способный к перекрестной гибридизации с искомым продуктом, или если использовать синтетический олигонуклеотид, соответствующий какому-либо фрагменту известной аминокислотной последовательности исследуемого ; антигена. Такой олигонуклеотид можно использовать как затравку для синтеза комплементарной ДНК в смеси молекул мРНК, в которой искомая мРНК содержится в минимальных количествах. Этот подход успешно использовали Суд и др. [39] для получения зонда кДНК молекул HLA класса I человека.
При получении клонированной кДНК антигена Н-2КЬ мыши Рейес и др. [37, 38] избрали другой путь, также основанный на использовании синтетического олигонуклеотида. Эти исследователи использовали последовательность : остатков Н-2КЬ в положениях 51—56:
Тгр Met Glu Gin Glu Gly TGG ATG GAA CAA GAA GGX G G G
Поскольку в этой последовательности для двух Glu и одного Gin в третьем положении кодона может быть одно из двух оснований, был синтезирован олигонуклеотидный зонд, содержавший смесь всех восьми возможных последовательностей. Синтезированный продукт включал последние два основания кодона Тгр и первые два — кодона Gly. Кроме того, был синтезирован второй зонд из 11 нуклеотидов, основанный на последовательности аминокислотных остатков 58—61 молекулы К6. На следующем этапе проводили скрининг библиотеки кДНК; для дальнейших исследований были выбраны клоны, гибриди-зовавшиеся с обоими олигонуклеотидными зондами. Таким путем был получен фрагмент ДНК, соответствующий последовательности аминокислотных остатков 50—91 молекулы Н-2КА
14.2.6.2. Организация генов класса I
Использование зондов молекул класса I позволило выйти на новый уровень анализа генов класса I и их продуктов. Появилась возможность выяснить, например, следующие вопросы: сколько генов продуктов класса I содержится в индивидуальном геноме, как эти гены организованы, претерпевают ли гены МНС перестройки в процессе дифференцировки, могут ли гены МНС экспрессироваться в новых клетках-хозяевах и т.д.? Прежде чем обсуждать эти новые важные направления, рассмотрим соображения, связанные с новой информацией о структуре продуктов класса I, полученной благодаря работам по сек-венированию ДНК.
Как отмечалось ранее, полная последовательность цепей известна лишь для некоторых антигенов класса I. Поэтому информация, полученная в результате секвенирования ДНК, значительно расширила наши знания в данной области. В особенности это касается тех случаев, когда частичное определение последовательности белка оказывалось достаточным как для выявления положительной корреляции с последовательностью гена, так и для установления полной структуры определяемого антигена на основе сочетания косвенных данных, минуя прямой анализ. Полное секвенирование гена Н-2КЬ мыши позволило внести ряд поправок в принятую последовательность белка — в том числе были добавлены два аминокислотных остатка на С-конце. При сравнении последовательностей белка и гена несоответствия были обнаружены лишь в двух положениях; не исключено, что эти несоответствия отражают реальные различия. Например, они могут быть следствием дивергенции по гену Н-2КЬ двух субштаммов лейкоза EL4, использованных авторами двух работ. К тому же, основываясь на данных о многочисленности генов класса I (см. далее в настоящей главе), следует учитывать следующую возможность: белок и клон кДНК вполне могут представлять собой два различных, хотя и близкородственных, реплик ата гена Кь.
