Иммунология. Том 2 - Дэвид Г.
ISBN 5-03-000497-1
Скачать (прямая ссылка):
Трудности, связанные с выделением антигенов МНС в количествах, достаточных для структурных исследований, были частично преодолены при изучении антигенов HLA-A и HLA-В человека. В этих опытах культивируемые in vitro линии клеток подвергали скринингу и отбирали линии, продуцирующие аномально высокие количества искомого антигена. Когда удалось получить такие линия от гомозиготных индивидуумов, появилась возможность, используя крупномасштабные методы культивирования, выращивать такие клетки в килограммовых количествах. Эти позволило выделять антигены с помощью обычных биохимических методов и определить их первичную структуру обычным методом секвенирования пептидов. С помощью таких процедур Строминжер [9] полностью или почти полностью расшифровал первичную структуру антигенов HLA-A2 и HLA-B7.
Помимо крупномасштабного выращивания клеток используют также методы, основанные на введении радиоактивной метки в антигены МНС. Например, белки клеточной поверхности можно метить радиоактивным иодом по методу, при котором метка присоединяется к остаткам тирозина на определенных молекулах. Белки можно также пометить, выращивая клетки в культуральной среде, содержащей 3Н-, 14С- или 358-аминокислоты. Методический подход с применением радиоактивной метки имеет то преимущество, что для выделения искомых антигенов можно использовать иммунологические реагенты, не опасаясь проблем, связанных с загрязнением нерадиоактивными белками. Анализу подвергается только радиоактивный материал, поэтому немеченый белок не мешает и может даже быть полезен в качестве носителя радиоактивных молекул. Эта методология нашла широкое применение при изучении продуктов МНС; ее можно использовать также при сравнительном структурном анализе и в более полных структурных исследованиях. Использование радиоактивной метки позволило определить полную аминокислотную последовательность антигенов класса I мыши.
Существует целый ряд методов, позволяющих преодолевать трудности, связанные с нерастворимостью МНС-структур. На ранних этапах изучения антигенов класса I эта проблема была сведена к минимуму путем «срезания» антигенов с клеточной поверхности с помощью протеолитического фермента папаина. Под действием этого фермента гидрофобная часть молекулы остается
© *н \ “С Аминокислоты^
©
:----*~0g0 Клетки EL'4
(Культивирование (4-6ч)
Лизис детергентом NP-40
Колонка с лентиллектином
-Белковый пул
а-Метилманнозид (2%)/
Рис. 14.1. Процедура выделения радиоактивно меченных молекул Н-2.33 (КЬ) /т\ для анализа аминокислотной последо-вательности.
В большинстве определений использовали аминокислоты, меченные тритием; для локализации перекрывающихся пептидов, полученных при ферментативном расщеплении, использовали 14С-аминокислоты, при изучении ди-сульфидных мостиков молекулы — (5)
35S-Cys. ([6]; печатается с разрешения.)
Гликопротеиновый пул
Иммунопреципитация
1) Мышиная аллоимунная сыворотка
2)Козья антисыворотка против ИММУНОГЛОБУЛИНОВ мыши
, Гель-фильтрация на колонке чс сешадексом G-75 .В присутствии 1М
^муравьиной кислоты
Ы
Н-2
погруженной в клеточную мембрану, а несущий антигены внеклеточный участок отщепляется и может быть выделен из надосадочной жидкости. Очевидно, что этот метод позволяет получать лишь неполные молекулы класса I без мембранного и цитоплазматического участков. Для получения антигенов класса II расщепление папаином неэффективно; обработка ферментом снимает с поверхности клетки лишь около 10% антигенов класса II.
Более общий методический подход к изучению нерастворимых антигенов включает в себя применение неионных детергентов, которые, солюбилизируя плазматическую мембрану, «освобождают» мембранные антигены. Особенно удобными оказались растворы детергентов, воздействующие только на плазматическую мембрану и не повреждающие ядерной мембраны. Антигены можно выделять из детергентсодержащих супернатантов с помощью обычных иммунологических методов, поскольку неионные детергенты не влияют на реакции антител.
На примере работы с солюбилизированными детергентом клетками, включившими метку в процессе роста в среде, содержавшей радиоактивные аминокислоты, можно сформулировать общую схему выделения мембранных антигенов МНС. Применение этой схемы в случае выделения молекул Н-2 мыши изображено на рис. 14.1. До применения иммунологических методов экстракты, полученные с помощью детергента, можно фракционировать на колонках слектином и получить гликопротеиновые фракции. Выделенные антигены легко разделить на составляющие их цепи путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) или путем гель-фильтрации в диссоциирующем растворе.
Прогресс, наблюдаемый в области микросеквенирования белков и в методах разделения гель-электрофорезом, позволит в будущем работать с не мече-
