Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
4. В каждую пробирку добавляют 0,05 мл сыворотки или плазмы небе-ремеиных женщин или же каких-либо животных, например коров или лошадей
5. Инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре
6. Добавляют 1 мл 20%-ного раствора полиэтиленгликоля и проводят дальнейшую обработку по методике, описанной в табл. 5.3
7. Пробирку помещают в углубление кристалла гамма-счетчика и считают в течение 10 с
8. Строят график, откладывая по оси ординат процент связанной метки, а по осн абсцисс — логарифм разведения аитисыворотки (см. рис. 1.2)
Примечания. Описанная выше методика выбрана произвольно из огромного числа возможных вариантов, и все они, по-видимому, привели бы в конечном счете к одним и тем же результатам. Тем не менее можно сделать несколько общих замечаний касающихся отдельных стадий методики:
(а) Как показывает опыт, иамиого лучше готовить исходную серию разведений (объем 1 мл) и разливать аликвоты этих растворов по пробиркам, а не готовить две серии пробирок путем двукратных разведений в 0,25 мл.
(б) Выбор объема (0,25 мл) определяется двумя факторами: во-первых, объем раствора при окончательной инкубации составляет 0,5 мл, а, во-вторых, отдельные реагенты следует добавлять именно в таких объемах с тем, чтобы их можно было точно и правильно разливать по инкубационным пробиркам, используя обычно применяемое для этой цели стандартное оборудование (дозаторы). Вполне допустимы и другие объемы (например, 0,05 мл раствора Ат и 0,4 мл раствора метки), если при нх использовании удается правильно устанавливать конечные концентрации.
(в) Те же рассуждения, которые относятся к объему растворов, относятся и к метке.
Общее количество добавляемой метки, а также необходимое время счета могут быть самыми разными в зависимости от анализируемого вещества. Общие принципы подбора этих параметров рассматриваются в разд. 8.2.1 и 8.3.
(г) Объем сыворотки подбирается таким образом, чтобы он составлял 10% общего объема инкубационной смеси. При меньшем объеме трудно разливать ее с высокой степенью точности, а при большем объеме могут возникать неспецифические эффекты (см. разд. 9.3).
Продолжение табл. 1.2
(д) Для времени и температуры инкубации, так же как и для других параметров, возможны вариации в широких пределах. При иалажи-иании нового метода анализа необходимо детально исследовать влияние этих параметров и начать с построения кривых разведения при инкубации в течение 1, 4, 24 и 48 ч при 4°С, при комнатной температуре и при 37 °С. Вопрос о необходимости более продолжительной инкубации приобретает особенно важное значение в тех случаях, когда требуется высокая чувствительность.
(е) При определении ПЛЧ можно воспользоиаться практически любым методом разделения (см. табл. 5.1). Метод, предусматривающий применение полиэтиленгликоля, был выбраи благодаря его эффектииности и простоте.
(ж) Не рекомендуется определять обшую радиоактивность в каждой пробирке. Это может лишь помочь определить ошибку, связанную с раз-лиианием метки, но не может способствовать обнаружению более серьезных ошибок, связанных с разливанием других реагентов.
Замечание: Большинство поступающих в продажу наборов для радиоиммуиоло-гического определения ПЛЧ содержит избыток антител (для уменьшения чувствительности системы), и этот избыток можно использовать для приобретения навыков построения кривых разведения связывающих агентов.
Таблица 1.3
Построение калибровочной кривой
(радиоиммунологический метод определения плацентарного лактогеиа человека)
Буфер для разведения тот же, что и в табл. 1.2
1. Готовят стандартные растворы ПЛЧ в свободной от ПЛЧ сыворотке или плазме, используя для этого исходный стандартный раствор, содержащий 1 мг/мл ПЛЧ (табл. 2.1)
2. В двойной ряд пробирок разливают по 0,05 мл стандартного раствора каждого разведения. Кроме того, готовят диойной ряд пробирок, содержащих сиободную от ПЛЧ сыворотку без стандарта: одна пара этих пробирок служит в качестве холостой пробы, а другая — и качестве «иулеиого стандарта» (см. рис. 1.7); в остальные дублированные пробирки разливают плазму или сыворотку, полученные от женщин иа поздней стадии беременности
3. В каждую пробирку добавляют 0,2 мл раствора 1251-ПЛЧ, разведенного из расчета, чтобы общее число импульсов в пробе составляло 10 000— 15 000 за 10 с. Для определения общего количестиа добавленной радиоактивности одну пару пробирок заполняют только раствором, содержащим меченый лиганд
4. В каждую пробирку приливают по 0,25 мл аитисыворотки к ПЛЧ и разведении 1 :500; в холостые пробы вместо антисыворотки добавляют 0,25 мл буфера
5. Иниубируют в течение 1 ч при комнатной температуре
6. Добаиляют 1 мл 20%-иого раствора полиэтиленгликоля и проводят дальнейшую обработку по способу, описанному в табл. б.З
Продолжение табл. 1.3
7. Просчитывают радиоактивность осадка во всех пробах
