Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
где [Аг] обозначает концентрацию свободного аитигеиа, [Ат] — концентрацию свободных антител и [АгАт] — коицеи* трацию комплекса АгАт, а величина К представляет собой константу равновесия, характеризующую сродство антитела к антигену ]. Поскольку конечные концентрации определяются константами скоростей прямой и обратной реакций, очевидно также, что
К-4г- <‘-6>
Для каждой данной системы величина К является мерой изменения свободной энергии, сопровождающего реакцию между исходными реагентами, в данном случае между Аг и Ат. При определенных исходных концентрациях большая величина К будет означать, что концентрация комплекса АгАт в состоянии равновесия будет намного выше, чем концентрация свободных Аг и Ат, тогда как низкая величина К будет означать обратную ситуацию.
Допустим, что мы имеем систему с заданной величиной К, в которой исходные молярные концентрации Аг и Ат равны, причем Аг и Ат подобраны таким образом, что в состоянии равновесия они одинаково распределены между свободной и связанной фазами. Предположим также, что исходная концентрация каждого из реагентов равна 2 (эта величина может быть выражена в любых единицах). Тогда в состоянии равновесия
Аг + Ат ч=* АгАт. (1.6)
1 1 1
Рассмотрим только антиген. Одна единица Аг связана и одна свободна. Теперь рассмотрим ту же систему, когда в ней присутствуют 4 единицы Аг и только 2 единицы Ат. Из закона действующих масс следует, что увеличение концентрации реагентов в одной части уравнения должно привести к соответ-
* Величину К выражают в литрах иа моль (л/моль), что с первого взгляда может показаться странным. Такое обозначение связано с тем, что величина К получается делением одной концентрации (моль/л) на произведение двух других концентраций, т. е.
моль/л 1 .
----;------— = ------т— = л/моль,
(40ль/л • моль/л щолъ//\
ствующему увеличению в другой его части, а именно увеличение количества Аг или Ат или обоих реагентов должно привести к соответствующему увеличению концентрации АгАт в состоянии равновесия. Но в описываемом случае увеличение концентрации АгАт в состоянии равновесия не может быть эквивалентным увеличению количества Аг, поскольку количество Ат осталось неизменным. Таким образом, концентрация комплекса АгАт будет повышаться, но при этом концентрация свободного Аг будет повышаться в еще большей степени. Для иллюстрации такой ситуации воспользуемся чисто произвольными цифрами
Аг + Ат =*=* АгАт. (1.7)
2,8 0,8 1,2
Рассмотрим опять только антиген. 1,2 единицы Аг будут связаны, но 2,8 единицы останутся свободными. В ситуации, описываемой уравнением (1.6), соотношение между связанным и свободным антигеном было равно 1,0. При добавлении большего количества антигена это отношение снизилось до 1 2
Yg- ев 0,43. Отсюда можно сделать следующий вывод: при неизменном количестве связывающего агента и заданной величине К отношение связанного лиганда к свободному в состоянии равновесия будет находиться в количественной зависимости от суммарного количества присутствующего лиганда. В этом, собственно, и состоит основной принцип всех методов связывания.
Мы пока не касались вопросов о метке, стандартах и способах разделения свободной и связанной фаз, поскольку эти вопросы являются не определяющими, а второстепенными по сравнению с основным принципом метода. Так, например, в большинстве случаев, если не всегда, меченый лиганд бывает совершенно идентичен немеченому лиганду не только в свободном виде, но и в составе комплекса со связывающим агентом. В этих условиях конечное распределение лиганда между свободной и связанной фазами будет определяться общим количеством лиганда и не зависеть от соотношения между количествами меченого и немеченого лиганда. Метку применяют просто потому, что ее использование дает удобный в техническом отношении способ измерения распределения лиганда между свободной и связанной фазами; то, что использование меченого лиганда не имеет отношения к основному принципу метода, видно хотя бы из того факта, что в качестве меченого компонента с таким же успехом может быть использован связывающий агент (см. разд. 5.4). Из сказанного следует, что термин «конкуренция», который часто используют для характеристики взаимоотношений между меченым и немеченым
лигандом, является в этом случае неуместным. В большинстве методов связывания меченый й немеченый лиганд имеют одинаковую возможность связываться со связывающим агентом, и конечный результат зависит от общего количества присутствующих молекул лиганда.
Непринципиальным является также вопрос о стандартах, в качестве которых может быть использован, например, набор растворов очищенного гормона (разных концентраций), по которым можно судить о количестве гормона в неизвестной пробе. В принципе можно представить себе ситуацию, когда, зиая точные концентрации метки и связывающего агента, а также величину К, можно определить концентрацию измеряемого вещества путем простого расчета, не прибегая к помощи стандартов. Однако практически это сделать невозможно из-за непредсказуемости поведения реагентов. Наконец, еще одним фактором методического характера, не имеющим отношения к основному принципу, является вопрос о разделении свободной и связанной фаз, поскольку, как мы увидим дальше, существуют системы, в. которых такое разделение не является обязательным и о распределении можно судить по изменению характеристик меченого лиганда при его связывании со связующим агентом.
