Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Среди методов, рассматриваемых в настоящем разделе, наиболее известны методы, в которых стероидные гормоны и другие низкомолекулярные соединения подвергаются экст-
ракции путем распределения между органическими растворителями. Вслед за экстракцией может проводиться (хотя и не обязательно) хроматографирование. К методикам этого типа применимы практически те же общие критерии, которые были рассмотрены при обсуждении методов адсорбции с применением мелкозернистых адсорбентов (см. разд. 6.1).
6.2.1. Экстракция с целью повышения специфичности
Известно множество случаев, когда при использовании методов связывания возникают недоразумения вследствие присутствия в биологических жидкостях веществ, близких по структуре к анализируемому лига иду. Лучше всего это видно, пожалуй, на примере анализа стероидных гормонов, особенно в тех случаях, когда в качестве связывающего агента используются природные связывающие белки. Как уже подчеркивалось в разд. 4.3, связывающие агенты этого типа явно обладают широкой специфичностью, и несколько приведенных ниже примеров показывают, как с помощью экстракции можно преодолеть эту трудность.
1) Возможность количественного, определения прогестерона с использованием транскортина в качестве связывающего агента затруднена тем, что, помимо прогестерона, транскор-тин связывает целый ряд кортикостероидов и других стероидов. С целью повышения специфичности проводят экстракцию петролейным эфиром, избирательно экстрагирующим прогестерон, и таким образом обеспечивают достаточно надежный анализ этого стероида (Johanson, 1969).
2) Возможность количественного определения андрогенов с использованием в качестве связывающего агента глобулина, связывающего половые гормоны, затруднена тем, что ГСПГ связывает ряд 17|}-окси-С19-стероидов и в том числе тестостерон и эстрадиол. Простая экстракция органическим растворителем позволяет разделить и затем количественно определить вещества, подобные тестостерону (Anderson, 1970). Хотя в данном случае анализу подвергается смесь веществ, тем ие менее такое определение дает представление об андрогенной активности. Для определения тестостерона требуется предварительно провести хроматографирование, в ходе которого удается полностью разделить все 17|3-оксистероиды.
3) Возможность количественного определения эстрогенов с использованием связывающего агейта из цитозоля матки затруднена тем, что этот связывающий агент обладает сродством по отношению ко всем классическим эстрогенам, включая эстрон, эстрадиол и — в какой-то степени — эстриол. В связи с этим обстоятельством для определения какого-либо
Рис. (.3. Разделение меченных тритием эстроиа (/), эстраднола (//) и эстриола {III) при помощи гель-фильтрации. 0,1 мл смеси с радиоактивностью 50 ООО имп/мин наносили иа колонку с сефадексом LH-20 (10 см Х0.5 см) и затем элюировали смесью хлороформ -гексаи — метанол (46 : 46 : 8 по объему). Такой способ разделения обеспечивает возможность специфического анализа любого нз трех эстрогенов при помощи сравнительно мало иеспецифического метода связывания. (Данные любезно предоставлены д-ром
С. Кошроу.)
эстрогена в отдельности приходится проводить экстракцию и хроматографирование (рис. 6.3).
В случае стероидов, лекарственных препаратов и других иизкомолекуляриых соединений существует чрезвычайно широкий выбор способов экстракции органическими растворителями. Выбраииую систему необходимо тщательно проверить согласно описанным выше критериям; такая проверка необходима даже для опубликованных и широко применяемых методов, поскольку качество реактивов, в особенности органических растворителей, может быть очень разным.
Проблемы, связанные со специфичностью основных реагентов, возникают не только при определении стероидных гормонов. С ними сталкиваются также при анализе белков и пептидов, особенно в тех случаях, когда они присутствуют в биологических жидкостях в раличных молекулярных формах.
Относительно низкая специфичность связывающих белков плазмы, несомненно, является серьезным недостатком, если говорить о методах анализа, основанных на использовании этих белков. По этой причине указанные методы анализа были быстро вытеснены иммунологическими методами, в которых связывающий агент обеспечивает достаточно высокую специфичность. Возвращаясь к приведенным выше примерам, следует отметить, что в настоящее время уже доступны антисыворотки, обладающие высокой специфичностью по отношению к прогестерону, тестостерону и трем классическим эстро-
генам. При помощи этих антисывороток можно проводить количественное определение соответствующих стероидов уже после простой экстракции органическим растворителем без последующего хроматографирования. В некоторых случаях количественное определение можно проводить непосредственно в анализируемой жидкости, даже не подвергая ее экеТрак-ции.
6.2.2. Экстракция с целью освобождения лигаида И8 конъюгатов или комплексов
Эндогенный лиганд может находиться в биологической жидкости в такой форме, в которой он недоступен для прямого количественного определения, например в виде конъюгата или ъ комплексе со связывающим белком плазмы.
