Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
УСЛОВИЕ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА СВЯЗЫВАНИЯ-ЭКСТРАГИРОВАНИЕ ЛИГАНДА ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ
Методика радиоиммунологического анализа в большинстве случаев сводится к простому перемешиванию образца, меченого лиганда и связывающего агента. Однако иногда требуется дополнительный этап, включающий подготовку лиганда к анализу: во-первых, если метод недостаточно чувствителен, то эндогенный лиганд приходится концентрировать, и, во-вторых, если метод анализа недостаточно специфичен, то эндогенный лиганд должен быть отделен от других веществ. Указанные задачи решаются при помощи различных методов экстракции.
Методы экстракции можно разделить на два основных типа. Согласно методам первого типа содержащийся в образце лиганд адсорбируют на частицах какого-нибудь материала, а затем легко отделяют его от неадсорбировавшихся компонентов; согласно методам второго типа образец обрабатывают несмешивающимся органическим растворителем, экстрагирующим лиганд. Метод адсорбции иа частицах чаще всего используют для того, чтобы ' сконцентрировать лиганд перед анализом (например, в случае небольших пептидных гормонов). Экстракцию органическими растворителями проводят обычно в тех случаях, когда лиганд необходимо отделить от других компонентов (например, при анализе стероидных гормонов).
6.1. Экстрагирование с целью концентрирования лиганда
Концентрация в крови некоторых важных веществ биологического происхождения (таких,' например, как АКТГ, окси-тоцин, вазопрессин или ангиотензины) не. превышает в норме нескольких пикограммов и даже фемтограммов. Эти концентрации находятся ниже или на самой границе чувствительности большинства радиоиммунологических методов анализа (даже при полной их оптимизации; см. разд. 8.2), в связи с чем приходится проводить концентрирование лигандов.
Стандартный метод анализа Анализ после экстракции
ЮОмкл образца (!пг)
Ч_/
ЮОмнл экстракта (SOnr)
Рис. 6.1. Схема, иллюстрирующая, каким образом стадия экстракции может значительно повысить чувствительность метода связывания.
Если использовать методы экстрагирования лигаида и концентрирования раствора, то в принципе не существует какого-либо предела для повышения чувствительности метода. Более того, при этом можно добиться значительного повышения специфичности анализа. На практике чаще всего приходится анализировать плазму крови и мочу, которые сильно различаются по своей природе: в плазме содержатся в высокой концентрации белки и в низкой, относительно постоянной концентрации электролиты и мочевина, тогда как в моче белок практически отсутствует, а электролиты и мочевина содержатся в высоких и варьирующих концентрациях. Методы, разработанные для плазмы крови и мочи, как правило, впол-не применимы для анализа остальных биологических жидкостей, в том числе экстрактов тканей.
Проведение экстракции и концентрирования дает следующие преимущества:
1) Концентрирование эндогенного лиганда. Экстракция лиганда из относительно большого объема исходной жидкости позволяет получить экстрак±, имеющий значительно меньший конечный объем. Этим путем можно заметно повысить чувствительность иммунологического анализа, поскольку она целиком зависит от концентрации лиганда, а не от его абсолютного количества (рис. 6.1).
2) Повышение специфичности. Методика, используемая для концентрирования анализируемой жидкости, может служить также для повышения специфичности анализа. Более детально этот вопрос рассматривается в разд. 6.2.
3) Предотвращение повреждения эндогенного или меченого лиганда. Многие соединения, в частности небольшие пептидные гормоны, присутствуют в плазме или в сыворотке вместе с ферментами, способными вызывать их разрушение. Так, например, в плазме, полученной при поздней беременности, окситодин быстро разрушается присутствующей в крови окситоциназой — ферментом плацентарного происхождения. Во многих случаях в результате экстракции удается отделить лиганд от примесей подобного рода.
6.1.1. Методы экстракции и концентрирования,
основанные на применении мелкозернистых адсорбентов
В принципе любой физико-химический метод, применяемый для очистки биологических материалов, может быть использован для экстракции в процессе анализа. Часто, однако, те методы, которые вполне пригодны для однократной очистки всего материала, нельзя использовать для экстракции в процессе анализа, когда приходится обрабатывать десятки или сотни образцов. Способ экстракции, применяемый в аналитических методах, должен отвечать следующим практическим требованиям: 1) он должен быть простым и быстрым, чтобы с его помощью можно было проводить большое число определений; 2) должен обеспечивать повышение чувствительности за счет концентрирования лиганда в значительно меньшем объеме по сравнению с исходным; 3) при его использовании концентрирование лиганда не должно сопровождаться концентрированием неспецифических примесей, в том числе ферментов, разрушающих лиганд; 4) метод должен давать воспроизводимую степень извлечения, не менее чем 50% лиганда от его содержания в исходном материале; 5) процесс экстракции не должен вызывать денатурации или изменения связывающих свойств лиганда; 6) адсорбенты должны быть легко доступны и не должны различаться от партии к паргии.
