Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Чард Т. -> "Радиоиммунологические методы" -> 54

Радиоиммунологические методы - Чард Т.

Чард Т. Радиоиммунологические методы — М.: Мир, 1981. — 248 c.
Скачать (прямая ссылка): radioimunnologicheskiemetodi1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 48 49 50 51 52 53 < 54 > 55 56 57 58 59 60 .. 100 >> Следующая

иодируют in situ обычным способом с применением хлорамина Т, используя такое количество изотопа 1251, при котором степень иодирования составляет 1—2 атома иода на молекулу антитела. Для удаления оставшегося иодида и поврежденных продуктов твердую фазу промывают, а затем при pH 3,0 элюируют антитела, обладающие низким сродством, а при pH 2,0 — антитела, обладающие более высоким сродством. Очищенные таким образом меченые антитела собирают в нейтральном буферном растворе и хранят их либо в свободном виде, либо предварительно связав для повышения стабильности с иммуносорбентом.
При проведении самого анализа (рис. 5.10) образцы и стандарты инкубируют при соответствующей концентрации меченых антител, которую подбираюг эмпирически. После установления равновесия извлекают несвязавшиеся антитела избытком иммуносорбента, который после некоторого периода инкубации осаждают, промывают и просчитывают. Чем больше лиганда присутствует в образце, тем больше меченых антител будет находиться в форме растворимого комплекса с
Jfom/vecmee инсулина е пробе,
лг
Рис. 8.11. Калибровочная кривая, полученная при проведении иммуиорадиометрнчс* ского анализа по схеме, показанной иа рисунке 5.10.
антигеном и, следовательно, тем меньше их будет связываться с иммуносорбентом. В результате получают калибровочную кривую (рис. 5.11), дающую прямую зависимость между числом импульсов в надосадочной жидкости и количеством присутствующего лиганда.
Разновидностью описанного метода является метод двойного связывания (Addison, Hales, 1971). При помощи иммобилизованного анти'гела экстрагируют антиген из биологической жидкости, отделяют образующийся нерастворимый комплекс и позволяют ему реагировать с очищенным меченым антителом: если молекула антигена обладает по меньшей мере двумя участками связывания, то число вступивших в реакцию меченых антител будет пропорционально количеству присутствующего лиганда. Потенциальные преимущества этого метода заключаются в том, что он дает возможность избежать некоторых неспецифических эффектов, обусловленных присутствием различных факторов в биологической жидкости, а также позволяет повысить чувствительнось, поскольку можно проводить экстракцию относительно больших объемов жидкости. В качестве другого варианта этого метода, особенно ценного в тех случаях, когда доступны лишь небольшие количества антител, применяется непрямая методика, при которой используют очищенные антитела, меченные препаратом 125I-aHTH-IgG (Hales et al., 1975).
5.4.1. Преимущества и недестатки иммунсрвдиометрическсгс метода енелизе
Иммунорадиометрический метод анализа обладает следующими преимуществами: 1) лиганд не иодируется, и, стало быть, нет опасности его повреждения при обработке (см. разд. 3.7.3); что же касается антител, то поскольку их молекулы крупнее и относительно стабильнее, они не так подвержены повреждению в процессе иодирования; 2) поскольку антитела находятся во время иодирования в комплексе с иммуносорбентом, их антигенсвязывающие участки защищены; 3) метод может быть использован для анализа веществ, с трудом поддающихся иодированию (например, пептидов, лишенных тирозиновых остатков); 4) меченые антитела, особенно в комплексе с иммуносорбентом, могут довольно долго сохраняться (около двух месяцев); 5) поскольку из гетерогенной популяции антител, присутствующих в антисыворотке, можно отбирать только те молекулы, которые обладают высоким сродством, метод может быть чувствительнее, чем обычные методы; последнее преимущество является, однако, скорее потенциальным, чем реальным, поскольку ни экспериментальным, ни теоретическим путем пока не удалось подтвердить повышения чувствительности; 6) с помощью метода двойного связывания можно отбирать и анализировать только те молекулы, которые содержат оба антигенных участка.
Однако наряду с преимуществами для иммунорадиомет-рического метода характерны следующие недостатки: 1) приготовление основных реагентов отнимает много времени и требует высокой технической квалификации; 2) так же как и в случае других твердофазных систем, в связи с потерями при иммобилизации и очистке расходуются большие количества реагентов, в связи с чем метод не может быть использован при дефиците реагентов; 3) метод не годится для систем, в которых комплекс антиген — антитело обладает высокой константой диссоциации, поскольку добавление избытка иммобилизованного антигена в конце инкубации может нарушить равновесие первичной реакции антиген — антитело.
В связи с указанными недостатками иммунорадиометри-ческие методы анализа не получили широкого применения. Единственным исключением является модифицированный вариант метода двойного связывания, предназначенный для ра-диоиммунологического анализа антигена гепатита В, для реализации которого можно воспользоваться имеющимся в продаже широко известным набором реактивов (Ausria, Abbott Laboratories). Важное преимущество этого метода анализа состоит в том, что такой набор не должен содержать стандартного препарата антигена, что избавляет от опасности работы с этим потенциально инфекционным материалом.
Предыдущая << 1 .. 48 49 50 51 52 53 < 54 > 55 56 57 58 59 60 .. 100 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed