Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
3. После последнего промываиия 0,1 М раствором NaHCCh переносят гель в стеклянную колбу, в которую добавляют 50 мл 0,1 М NaHC03, содержащие 1 мл раствора гамма-глобулииа, приготовленного так, как это описано в п. 1, и перемешивают мешалкой (25 об/мин) в течение 24 ч при комнатной температуре
4. Иммуносорбент промывают один раз 100 мл 1,0 М этаноламина, pH 8,0, путем непрерывного перемешивания в течение 2 ч, а затем последовательно промывают два раза 100 мл 0,5 М раствора ЫаНСОз, два раза 50 мл 0,2 М ацетатного буфера, pH 4,0, и два раза 100 мл буферного раствора, применяемого в анализе в качестве разбавителя [идентичен раствору, описанному в табл. 1.2, но содержит дополнительно 1% (объем/объем) твина-20 (Koch-Light Laboratories Ltd.)]; каждое промывание проводится при непрерывном перемешивании в течение 30 мин
Б. Строят калибровочную кривую по способу, описанному в табл. 1.3, используя вместо растворимых антител суспензию иммобилизованных антител. Оптимальное разведение иммобилизоиаииых антител будет разным для разных антисывороток, в связи с чем его необходимо подбирать экспериментальным путем, используя растворы разной концентрации
6. Все пробирки закрывают пробками н перемешивают путем их вращения (приблизительно 25 об/мин) в течение 1 ч при комнатной температуре
7. Проводят центрифугирование в течение 5 мни при 2000 g, открывают пробирки, отсасывают иадосадочную жидкость, оставляя в каждой пробирке постоянный объем (0,1 мл), и промывают однн раз буферным раствором (1 мл)
8. Каждую пробирку с осадком помещают в колодец у-счетчика и просчитывают радиоактиииость
9. Рассчитывают результаты (табл. 1.2)
обладающими магнитными свойствами (окись железа, покрытая полимером) (Nye et al., 1976). В последнем случае перемешивание и разделение может быть осуществлено путем простого приложения магнитного поля.
При проведении анализа твердофазным методом пробирки содержат образец или стандартный раствор, меченый ли-гаид, соответствующее количество иммобилизованных антител и детергент (твин-20), добавляемый для предотвращения агрегации частиц и неспецифической адсорбции меченого лиганда. После инкубации, проводимой при непрерывном перемешивании, осаждают с помощью центрифугирования твер*
дую фазу, удаляют надосадочную жидкость, промывают твердую фазу два-три раза буфером для удаления несвязав-шегося меченого лиганда и определяют радиоактивность твердой (т. е. связанной) фазы (табл. 5.5).
Твердофазные системы обладают рядом достоинств:
1) в принципе их можно использовать для всех связывающих агентов, способных ковалентно связываться с носителем; 2) они обладают высокой эффективностью и позволяют проводить практически полное отделение связанного лиганда; 3) при тщательном проведении анализа они обеспечивают высокую точность; 4) они значительно меньше, чем другие системы, подвержены неспецифическим эффектам, обусловленным влиянием плазмы или сыворотки. Вместе с тем твердофазные системы имеют определенные недостатки, из-за которых они не получили широкого распространения. Во-первых, приготовление основных реагентов является трудоемким процессом. Во-вторых, твердофазный носитель связывает не более 30% иммунной активности, присутствующей в исходном препарате гамма-глобулинов, вероятно, в связи с тем, что многие молекулы присоединяются к носителю через свои антигенсвязывающие участки; столь неэкономное расходование антисыворотки допустимо лишь при условии, что она доступна в больших количествах. В-третьих, присоединение к твердофазному носителю антител, специфичных по отношению к большим молекулам, приводит к потере сродства и, как следствие, к снижению чувствительности метода; правда, последнее обстоятельство имеет существенное значение только в тех немногих случаях, когда требуется исключительно высокая чувствительность. И наконец, что особенно важно, сама методика проведения анализа является более сложной по сравнению с другими методиками, поскольку во время инкубации приходится проводить непрерывное перемешивание, периодически открывая и закрывая пробирки, а также несколько раз промывать твердую фазу в конце анализа путем центрифугирования и отсасывания надосадочной жидкости. Из сказанного следует, что системы, в которых используется гранулированный твердофазный носитель, по техническим причинам мало подходят для тех видов анализа, в которых требуется большая пропускная способность.
5.3.7. Заключение. Выбер методики разделения
Идеальных методов разделения не существует. Для каждой аналитической системы приходится выбирать одну из рассмотренных выше методик, подходя к такому выбору критически и не придерживаясь слепо какой-то одной уже
описанной ранее методики. Известно немало случаев, когда сложный, а иногда и малоэффективный метод сохраняется в течение длительного времени только потому, что он был описан первым. Так, например, при анализе стероидов и небольших пептидов все еще применяют для разделения активированный уголь, хотя при его использовании в этих системах может происходить диссоциация комплекса и снижение эффективности. Между тем существуют другие системы, обладающие не меньшими, а возможно, и большими достоинствами, которые и следовало бы использовать в данном случае.
