Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Чард Т. -> "Радиоиммунологические методы" -> 50

Радиоиммунологические методы - Чард Т.

Чард Т. Радиоиммунологические методы — М.: Мир, 1981. — 248 c.
Скачать (прямая ссылка): radioimunnologicheskiemetodi1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 100 >> Следующая

д-ром А. С. Мак-Нейлн.)
лекса антиген — антитело. В присутствии избытка первого антитела осаждение иммунореактивной метки должно составлять приблизительно 100%. 2) Минимальное количество второго антитела, обеспечивающее полное осаждение. Использование большого избытка антитела, во-первых, делает анализ более дорогостоящим (см. ниже), а во-вторых, может вызывать явление, состоящее в том, что при избытке антител не происходит образования осадка (рис. 5.8). 3) Величина холостой пробы, т. е. то количество меченого лиганда, которое осаждается вторым антителом в отсутствие первого антитела. Эта величина не должна превышать 5%. Большая величина иногда связана с присутствием в антисыворотке антител, специфичных по отношению к лиганду.
4) И наконец, система вторых антител должна быть проверена в присутствии той жидкости (т. е. плазмы, сыворотки или мочи), которая подвергается анализу. Методика, дающая хорошие результаты при проведении анализа в буферном растворе, может в присутствии биологического материала подвести вследствие сильных неспецифических эффектов, приводящих к уменьшению степени осаждения или к увеличению значения холостой пробы, а иногда и к тому и к другому. Особенно велика вероятность подобного явления в тех случаях, когда объем анализируемого образца превышает 10% от общего объема пробы. Помехи, вызываемые в системе двойных антител плазмой или сывороткой, относят за счет присутствия в них высокомолекулярных глобулинов и комплемента (Morgan, Lazarow, 1963; Morgan et al, 1974). Мешать анализу могут также некоторые вещества, используемые при подготовке образцов (например, гепарин или ЭДТА).
Хорошо налаженный метод двойных антител не уступает по эффективности большинству других способов разделения, а иногда и превосходит их. Преимуществом системы двойных антител является также универсальность ее применения в радиоиммунологическом методе анализа. Так, например, хороший препарат антител, специфичных по отношению к гамма-глобулинам кроликов, можно с равным успехом использовать в любом анализе, если в качестве первых антител в нем применяется антисыворотка кролика. Однако с практической точки зрения метод двойных антител имеет два существенных недостатка. Первый из них заключается в том, что этот метод требует дополнительного периода инкубации, который может составлять от 1 до 24 ч и значительно увеличивает общую продолжительность анализа. Это обстоятельство имеет особенно большое значение для клинических анализов, число которых непрерывно увеличивается и ч которых первый инкубационный период составляет не бо-
лее 2 ч, а практическая ценность результатов тем больше, чем быстрее они могут быть получены. В одном из существующих методов (Hales, Randle, 1963) вторые антитела добавляются вместе с компонентами первичной реакции, и образующийся комплекс сразу выпадает в осадок, что позволяет одновременно проводить разделение, однако такой способ может приводить к потере чувствительности, и в связи с этим он лэ получил широкого применения. Скорость образования осадка можно повысить путем включения сульфата аммония или декстрана во второе антитело (Martin, Landon, 1975); это очень интересный подход, заслуживающий дальнейшего изучения. Второй практический недостаток метода двойных антител связан с трудностями получения реагентов. Уже отмечалось, что каждый новый препарат второго антитела приходится подвергать тщательной проверке, причем из числа препаратов, проходящих проверку, лишь немногие отвечают необходимым требованиям. Вторые антитела используются в относительно высоких концентрациях, поэтому количества антител, полученного от одного животного, может хватить лишь для ограниченного числа анализов. В связи с этим системы двойных антител являются сравнительно дорогими независимо от того, готовят их на месте или получают из коммерческих источников (например, от Wellcome Reagents Ltd).
Типичная методика разделения с использованием второго антитела описана в табл. 5.4.
Таблица 5.4
Разделение свободного н связанного лиганда прн помощи второго антитела
Методика, описанная в этой таблице, представляет собой модифицированную инструкцию к имеющемуся в продаже реагенту (Wellcome Reagents Anti-Rabbit Globulin, кат. № RD 17). Этот реагент выбран в качестве примера в связи с его широкой доступностью и хорошим качеством. Он может быть использован в любой системе, в которой в качестве источника первых антител применяется антисыворотка кроликов
1. Добавляют в качестве носителя нормальную сыворотку кроликов в буфер (0,1 мл/100 мл), применяемый для разбавления.
2. После окончания инкубации первичной реакционной смеси к ней добавляют 0,1 мл сыворотки, применяемой для осаждения (в соответствующем разведении), и проводят дальнейшую инкубацию в течение 18 ч при 4°С
3. Центрифугируют в течение 30 мин при 2000 g и выше
4. Сливают или отсасывают надосадочиую жидкости (см. табл. 5.3)
5. В осадке определяют радиоактивность (см. табл. 5.3)
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 100 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed