Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Методы фракционного осаждения являются простыми, быстрыми и дешевыми и в практическом отношении превосходят все остальные методы разделения свободного и связанного лиганда. В тех случаях, когда эти методы могут быть использованы (практически во всех случаях, за исключением анализа очень больших белковых молекул), они обеспечивают высокую воспроизводимость результатов, причем различия между партиями реагентов бывают незначительными. Типичный метод разделения, основанный на применении полиэтиленгликоля, приведен в табл. 5.3.
Таблица 5.3
Разделение свободного и связанного лиганда при помощи полиэтиленгликоля
1. Готовят 20%-ный (вес/объем) раствор полиэтиленгликоля (мол., вес. 6000) в фосфатном буфере (процесс растворения можно ускорить при помощи магнитной мешалки)
2. При помощи автоматического шприца добавляют двойной объем этого раствора к инкубационной смеси (т. е. 1 мл для тех условий, которые указаны в табл. 1.2 и 1.3)
3. Тщательно перемешивают полученную смесь на вихревом смесителе до получения опалесцирующего раствора. Нет необходимости ждать, пока суспензия коагулирует
4. Центрифугируют в течение 30 мин со скоростью не менее 2000 g. Контролировать во время центрифугировании температуру не обязательно, хотя при 4 °С результаты могут быть несколько лучше
5 Надосадочиую жидкость сливают или отсасывают. Лучше проводить отсасывание, используя для этой цели пастеровскую пипетку, соединенную с обычным водоструйным иасосом Вентури при условии, если используются пробирки не слишком большого диаметра
6. Пробирку с осадком помещают в колодец кристалла усчетчика и просчитывают радиоактивность
Аналогичным образом проводится разделение при помощи этанола (два объема) или сульфата аммонии (один объем насыщенного раствора).
5.3.5. Методы двойных антител
5.З.5.1. Двойвыо, или вторыо, антитела
В радиоиммунологическом методе анализа в качестве способа разделения широко применяется осаждение комплекса при помощи антител (вторые антитела), специфичных по отношению к связывающему агенту; впервые этот способ был применен Ютигером и др. (Utiger et at., 1962), а также Морганом и Лазароу (Morgan, Lazarow, 1963). Второе антитело должно обладать специфичностью по отношению к гамма-глобулинам того вида животных, от которого получено первое антитело; если, например, при анализе инсулина в первичной реакции используется специфичная по отношению к инсулину антисыворотка морских свинок, то для разделения можно использовать антисыворотку коз, специфичную по отношению к гамма-глобулинам морской свинки (рис. 5.7). Наиболее широко этот прием используется в радиоиммунологическом методе анализа, но он может быть применен' и по отношению к другим связывающим агентам.
Реакции иммунопреципитации наблюдаются только при высоких концентрациях антигена и антител, в связи с чем в большинстве радиоиммунологических методов анализа первичная реакция антиген — антитело не сопровождается образованием осадка. Для разделения методом двойных антител требуется относительно высокая концентрация вторых антител и соответственно большее количество гамма-глобулинов, обладающих той же видовой специфичностью, что и первые антитела. Поэтому вторые антитела всегда добавляют вместе с белком-носителем, представляющим собой цельную сыворотку или гамма-глобулины того вида животных, от которого получены первые антитела.
На начальной стадии метод разделения, основанный на использовании двойных антител, мало чем отличается от любой иммунологической методики, применяемой для количественного определения. Группу животных иммунизируют гамма-глобулином и полученную антисыворотку проверяют в опытах, аналогичных тем, которые показаны на рис. 5.6 (т. е. проводят осаждение меченого лиганда в присутствии и в отсутствие антител). Однако в данном случае необходимо подбирать концентрацию не только антител, но и тех гамма-глобулинов, которые применяются в качестве носителей, поскольку их оптимальные количества бывают разными для разных антисывороток. Такой подбор имеет исключительно важно значение, и при его проведении должны учитываться следующие факторы: 1) Полнота осаждения komij-
Молекулы /д& из cbz00p0m#& ггазьг, с/7еци#7иу//г>/е я/р& мярс/гди cewr/tit
Мале/гуль/ ItjS из а///пи-сыбор0Л7/ги лгорс/гяи csu/f/rir, слецйричяь/е at uw&77u#p
Мше/гуугб/ uffcyjtuffa
Рис. 5.7. Принцип разделения при помощи метода двойных антител. При добавления в качестве носителя нормальной сывороткн морских свннок образуется осадок, который содержит связанный лнганд.
Рис. 5.8. Осаждение ,Я1*ЛГ (0,1 иг) при помощи метода двойных антител. В качестве первого антитела была использована антнсыворотка кролика, специфичная по отношению к ЛГ (конечное разведение в 40 000 раз), в качестве второго антитела — антисыворотка козы, специфичная по отношению к IgG кролика, а в качестве носителя—нормальная сыворотка кролика (конечное разведение в 20 раз). При слишком высокой концентрации второго антитела (разведение в 200 раз) осаждение бывает незначительным нлн вообще не наблюдается. При разведении вторых антител в 400 раз осаждение бывает максимальным, а при более инзких концентрациях постепенно уменьшается. Из сказанного следует, что в дайной системе концентрация второго аитнтела имеет очень большое значение. (Результаты любезно предостзвлены
