Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Чард Т. -> "Радиоиммунологические методы" -> 47

Радиоиммунологические методы - Чард Т.

Чард Т. Радиоиммунологические методы — М.: Мир, 1981. — 248 c.
Скачать (прямая ссылка): radioimunnologicheskiemetodi1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 41 42 43 44 45 46 < 47 > 48 49 50 51 52 53 .. 100 >> Следующая

Наиболее широко применяются методы адсорбции, в которых используются активированный уголь или силикаты.
5.3.3.1. Активированный уголь
Впервые активированный уголь был использован для разделения при радиоиммунологическом анализе инсулина (Herbert et al., 1965), и с тех пор широко применяется в различных методах анализа, в том числе в методах конкурентного связывания. В первоначальном варианте рекомендовалось подвергать активированный уголь предварительной обработке декстраном определенного молекулярного веса. Предполагалось, что такого рода покрытие должно блокировать более крупные поры, в которые может попадать связывающий агент, не мешая адсорбции свободного лиганда, имеющего более низкий молекулярный вес. Эта концепция является, вероятно, слишком упрощенной, поскольку рядом исследователей было показано, что покрытие не является обязательным, особенно если в состав инкубационной смеси входит сырд? ротка (Ekins, 1969; Binoux, Odell, 1973),
а
Комплекс свяЗб/ва/ащеео ' агента илагяг/Яа
Увстицв aScopffett/na Ceoffofff/ый лиганд
Рис. 5.3. Разделение при помощи адсорбента. Свободный лигаид может попадать в углубления иа поверхности частиц и прочно адсорбироааться иа них. Связанный лиганд не может проникать в этн углубления н в результате остается в жидкой фазе.
Разве&ехие ян/пи/ягл
Рис. 5.4. Влияние различных способов разделения иа определяемый тнтр аитисыворотки; в данном случае использованы две разные аитисыворотки, специфичные по отношению к окситоцину» н окситоцни, меченный изотопом 1Я1. Разделение проводится при помощи сульфата аммония (/ и II) или активированного угля (/// н IV). При использовании активированного угля определяемый тнтр намного ниже, поскольку активированный уголь конкурирует с антигеном н вызывает диссоциацию комплекса.
Из существующих препаратов активированного угля наиболее широко применяются препараты марки Norit (Norit SX1) с максимальным размером частиц 60 мкм. Разные партии этой серии могут значительно отличаться одна от другой, и никогда нельзя быть уверенным в том, что в банках с одинаковыми этикетками содержатся препараты, которые будут одинаково вести себя в процессе анализа. Поэтому необходимо тщательно проверять каждую партию перед использованием в стандартных анализах, и при наличии большой холостой пробы или низкого нулевого стандарта следует подобрать другую партию.
Иногда при детальном описании некоторых методов в литературе подчеркивается, что в процессе разделения необходимо тщательно контролировать такие факторы, как моляр-ность, температура (работа должна проводиться при 4°С) и время (после добавления активированного угля следует проводить центрифугирование в течение строго определенного промежутка времени). В тех случаях, когда такой контроль действительно необходим, лучше, вероятно, воспользоваться каким-либо другим методом разделения, поскольку малейшие отклонения, неизбежные при проведении анализа, рано или поздно обязательно приведут к погрешностям и потере точности. В табл.5.2 дано описание типичного метода разделения, в котором используется активированный уголь.
Таблица 5.2
Методика разделения связанного и свободного лиганда при помощи активированного угля, покрытого декстраном.
(Радиоиммунологический метод анализа АКТГ; Rees et al., 1971)
1. Готовят суспензию, содержащую 3,0 г активированного угля (Norit SX1, Hopkin and Williams Ltd.), 0,75 г декстрана T-70 (Pharmacia АВ), 10 мл 0,5 М фосфатного буферного раствора, pH 7,4, 60 мл лошадиной сыворотки (Wellcome Reagents Ltd.) и 100 мл деионизированной воды
2. Перемешивают суспензию при помощи магнитной мешалки
3. После окончания инкубации первичной реакционной смесн (см. Rees et al., 1971) добавляют в каждую пробирку 0,2 мл суспензии активированного угля, перемешивают и центрифугируют прн 2000 g в течение 15 мин при 4 °С или при комнатной температуре
4. Надосадочную жидкость отсасывают пастеровской пипеткой, соединенной с обычным водоструйным насосом Вентури
5. Пробирку с осадком, содержащим свободный лиганд, помещают в колодец кристалла у-счетчика и просчитывают радиоактивность
5.3.3.2. Силикаты
Мелкозернистые силикаты обладают хорошей адсорбирующей способностью, благодаря чему они широко используются во многих промышленных процессах. Их применяют
также для разделения в радиоиммунологическом методе анализа; с этой целью используют такие материалы, как тальк, Quso G-32 (Calbiochem), фуллерова земля и флори-зил. По принципу действия силикаты практически не отличаются от активированного угля; то же относится к достоинствам и недостаткам этого адсорбента. Если силикаты подходят для какой-либо системы, то их применение дает ряд практических преимуществ, но если они недостаточно эффективны или их применение требует тщательного контроля, следует подобрать другой метод разделения.
5.3.3.3. Гидроксилапатит
В некоторых системах, в частности при радиоиммуноло* гическом анализе стероидов, гидроксилапатит (BDH) адсорбирует не свободный, а связанный лиганд и его применение дает простой и быстрый метод разделения (Trafford et al., 1974).
Предыдущая << 1 .. 41 42 43 44 45 46 < 47 > 48 49 50 51 52 53 .. 100 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed