Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
антител класса IgE (см. разд. 4.2.1), специфичных по отношению к одному или нескольким из большого числа аллергенов. Чаще всего для обнаружения этих антител проводят кожную пробу in vivo, когда непосредственно у больного определяют реакцию на предполагаемый антиген. Однако в последнее время все чаще используется метод in vitro, при котором проводят реакцию между сывороткой больного и избытком иммобилизованного аллергена, связывающего антитела класса IgE, специфичные по отношению к этому аллергену. При этом твердую фазу промывают и инкубируют с мечеными антителами, специфичными по отношению к IgE; количество не^ посредственно связавшейся при этом радиоактивности находится в прямой зависимости от содержания в пробе IgE, специфичных по отношению к аллергену. Описанный метод носит название «радиоаллергосорбентная проба» (Wide et al., 1967). 5) Определение рецепторов эстрогенов в злокачественных опухолях молочных желез. Нормальная ткань молочных желез содержит рецепторы эстрогенов. Неопластическая' Ткань может содержать и не содержать рецепторов эстрогенов, и в зависимости от этого требуются различные виды гормональной терапии (McGuire, 1973). Цитозоль, полученный из клеток исследуемой ткани, инкубируют с 3Н-эстрадиолом в серии пробирок, содержащих различные концентрации немеченого эстрадиола. Для измерения соотношения между свободным и связанным лигандом отделяют свободный 3Н-эстра-диол путем его адсорбции на активированном угле. Анализируя полученные результаты по методу Скэтчарда (см. разд. 1.8), определяют концентрацию связывающего агента.
УСЛОВИЕ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА СВЯЗЫВАНИЯ— НАЛИЧИЕ СПОСОБА РАЗДЕЛЕНИЯ СВОБОДНОГО И СВЯЗАННОГО ЛИГАНДА
После завершения первичной реакции связывания лиган да необходимо измерить соотношение между свободным и связанным лигандом. Обычно (но не всегда) для этой цели приходится физически отделять комплекс, образующийся при взаимодействии лиганда со связывающим агентом, от несря» завшегося лиганда, причем существует большое число различных способов такого разделения. Все эти способы основаны на различии физико-химических свойств свободного и связанного лиганда; например, добавление органического растворителя в определенной концентрации может приводить к осаждению связывающего агента, а следовательно, и его комплекса с лигандом, но не осаждать свободный лиганд.
Главными критериями, предъявляемыми к методу разделения, являются эффективность и практичность. Разберем вначале оба эти критерия, после чего рассмотрим используемые в настоящее время методы.
5.1. Эффективность методов разделения
Говоря об эффективности методов разделения, имеют в виду полноту отделения комплекса от свободного лиганда (рис. 5.1). Имеет смысл проанализировать это определение и рассмотреть вопрос о том, какую роль в общей эффективности метода играет способ разделения и какую роль играют основные реагенты.
С теоретической точки зрения, идеальный метод разделения должен давать полное разделение двух компонентов системы. Однако достигнуть этого практически невозможно. Почти всегда некоторая часть свободного лиганда даже в отсутствие связывающего агента ведет себя так же, как связанный лиганд; это так называемая холостая проба метода. Так, например, можно показать, что при осаждении связанного лиганда химическими агентами в контрольных пробах.
не содержащих никакого связывающего агента, всегда осаждается некоторая часть свободного лиганда, хотя в этих условиях он должен был бы быть полностью растворим. Такое явление может объясняться следующими причинами: 1) физический захват свободного лиганда комплексом связывающий агент — лиганд, например из-за попадания свободного лиганда в образующийся осадок (степень захвата можно оценить количественно путем повторного промывания осадка или
юооо
6000
Число
ултлульсов
ШО
2000
Нереащиолло -¦СЛ0са#Л6/и мечельш лигам#
Реакциям# -•сласа&ль/й ме?ель/й лигала
Рпс. 5.1. Схема, иллюстрирующая эффективность метода разделения. В идеальном методе анализа весь меченый лиганд дол-жен был бы распределиться между свободной и связанной фазами. Практически же некоторая часть свободного лиганда будет определяться как связанный лнганд (холостая проба), а некоторая часть свободного лиганда будет состоять иа меченого лиганда, не обладающего реакционной способностью. Приведенные иа рисунке параметры могут сильно различаться для рааных лигандов н разных методов разделения.
по распределению изотопа, такого, например, как ^Na, который всегда остается в жидкой фазе); 2) присутствие в меченом лиганде примесей, близких по химическим свойствам к комплексу связывающий агент — лиганд; 3) адсорбция свободного лиганда (например, на стенках пробирки, в которой проводится анализ) и, наконец, 4) неполное разделение свободного и связанного лиганда в связи с тем, что они хотя и не идентичны, но тем не менее обладают (с точки зрения осаждения) сходными свойствами (см. рис. 5.6). На практике часто бывает трудно понять, за счет какого процесса следует отнести высокую холостую пробу. Более того, причины могут быть совершенно разными в зависимости от состава реакционной смеси; в частности, очень большое значение имеет на* личие или отсутствие сыворотки в смеси, и это необходимо учитывать в любой анализируемой системе.
