Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Титр. При наличии антисывороток, обладающих одинаковой специфичностью и одинаковым сродством, конечный выбор может зависеть от их титра (выражаемого величиной, обратной разведению, при котором связывается 50% меченого лигаида). Так, например, антисыворотку с титром 1:50 000 предпочитают антисыворотке с титром 1 :20 000, так как в первом случае с помощью 1 мл исходной сыворотки можио провести значительно большее число анализов. Следует подчеркнуть, что титр не является прямым отражением сродства,
поскольку он зависит также от общей концентрации антитела. Две разные антисыворотки дают одинаковые кривые разведения, если одна из них имеет в 10 раз меньшую величину К, но при этом содержит в 10 раз больше антител, чем другая.
4.2. <4. Хранение антисыверетек
Сыворотку обычно предпочитают плазме, поскольку в этом случае меньше вероятность образования криопреципитатов. Рекомендуется хранить сыворотку при —20 °С, предварительно разделив ее на аликвоты, чтобы свести к минимуму возможность повреждающего действия повторного замораживания и размораживания. Размер каждой порции должен зависеть от общего объема и от того, с какой скоростью используется антисыворотка. Размороженную порцию хранят, как правило, при 2—4°С с добавкой такого консерванта, как азид натрия (0,1%); при этих условиях антисыворотка остается стабильной в течение 3—6 мес.
4.3. Клеточные рецепторы
Первым этапом в действии каждого гормона является связывание его со специфическим макромолекулярным рецептором; который затем приводит в действие механизмы, обеспечивающие гормональный ответ клетки. Рецепторы стероидных гормонов находятся в цитоплазме клеток-мишеней, тогда как рецепторы белковых гормонов локализованы на поверхности плазматических мембран. Использование в методах анализа изолированных клеточных рецепторов в качестве связывающих агентов имеет одно важное преимущество, которое состоит в принципиальной возможности непосредственно определять функционально активный участок молекулы. Другие связывающие агенты в отличие от рецепторов могут связываться-с участками молекулы, удаленными от ее функционально важного активного центра, в связи с чем при их использовании могут определяться и неактивные фрагменты. Клеточные рецепторы обладают, кроме того, высокими константами сродства и могут поэтому обеспечить очень высокую чувствительность метода анализа (например, в случае анализа АКТГ чувствительность достигает 1—10 пг). Именно по этим причинам в последние годы появилось много сторонников рецепторных методов анализа. Впервые такой метод с использованием рецептора цитозоля клеток матки был Применен для анализа эстрогенов (Korenman, 1968) Впоследствии аналогичные методы анализа были описаны для кортикотропина (Lefkowitz, J970), гонадотропинов-(Catt et al,, 1972) и cAMP (Gilman,
1970): при анализе первых двух соединений были использованы рецепторы, экстрагированные из плазматических мембран органов-мишеней, а при анализе сАМР — связывающий белок из скелетных мышц.
Тот факт, что рецепторные методы анализа все-таки не получили широкого практического применения, можно отнести за счет присущих им недостатков. Во-первых, функциональная специфичность рецепторов может распространяться на молекулы, сильно различающиеся в химическом отношении: так, например, длительно действующий тиреоидный стимулятор может давать перекрестную реакцию в радиорецепторном методе, предназначенном для анализа ТТГ (Mehdi, 1975). Во-вторых, значительная часть рецепторов, расположенных на клеточной поверхности, может не участвовать в биологическом ответе клетки, что вызывает сомнения в их функциональной специфичности (Birnbaumer, Pohl, 1973). В-третьих, радиоре-цепторный метод можно использовать для анализа только тех соединений, для которых показано существование рецепторов, и его нельзя применить для анализа соединений, не обладающих гормональной активностью, таких, например, кака-фето-.. протеин или факторы свертывания крови. В-четвертых, возможность применения радиорецепторных методов анализа связана с рядом серьезных трудностей чисто практического характера, и это особенно важно. Получение препаратов рецепторов включает гомогенизацию ткани и фракционирование экстракта с использованием метода ультрацентрифугирования, а применение сложной методики может приводить к значительным различиям между препаратами. Многие препараты рецепторов не выдерживают длительного хранения, в связи с чем приходится довольно часто готовить их заново. И наконец, в-пятых, в случае радиорецепторного метода предъявляются значительно более жесткие требования к чистоте меченого лиганда, чем в случае радиоиммунологического метода. Наличие всех этих сложностей, возникающих при практическом применении радиорецепторного метода анализа, помогает понять, почему он пока еще не получил широкого применения за пределами научно-исследовательских лабораторий. Имеется, однако, сообщение об использовании радиорецеп-ториого метода для обычных лабораторных анализов хорионического гонадотропина человека (Landesman, Saxena, 1976).
