Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Одно время считалось, что у животного нельзя вызвать иммунную реакцию на его собственные антигены (так называемое явление «самоузнавания»). Однако теперь известны многочисленные случай успешной иммунизации веществами, которые в норме образуются в организме самого животного. В качестве примеров можно привести стероидные гормоны и пептидные' гормоны задней доли гипофиза, которые у самых разных видов имеют сходное химическое строение. Присутствие в крови антител к эндогенному гормону может вызывать резко выраженный физиологический эффект. Так, у животных, иммунизированных вазопрессином (антидиуретический гормон), иногда развивается, несахарный диабет, сопровождающийся сильной полиурией и полидипсией, а у животных, иммунизированных половыми стероидными гормонами, могут наблюдаться изменения функции гонад (Nieschlag, 1975).
4.2.5. Характеристики антител, имеющие вначение для методов связывания
1. Сродство. Величина К антисыворотки может достигать 1012 л/моль. Если принять, что чувствительность соответствует приблизительно I/К, то можно считать, что концентрация
определяемого лиганда может составлять всего лишь 1(Й2 моль/л нлн 1 цмоль/л. Эта потенциально возможная чувствительность является более чем достаточной для определения большинства веществ, представляющих интерес для биологов. Практически значения К для антител, используе-,мых обычно в радиоиммунологическом методе анализа, лежат в пределах 1,09—1012 л/моль.
2. Специфичность. Как правило, антитела обладают высокой специфичностью и способны обнаруживать малейшие различия в очень сходных между собой молекулах (см. разд. 9.2). С этим свойством антител связана другая характерная их особенность, а именно широта их применения. В противоположность природным связывающим агентам антитела могут быть получены к безгранично широкому кругу веществ, включая лекарственные препараты, для которых не существует эндогенных специфических связывающих агентов. Недостаток антител состоит, однако, в том, что они могут обладать специфичностью по отношению к участкам молекулы, которые не имеют отношения к ее биологической активности (см. разд. 11.4).
3. Доступность. Если удается добиться образования антител, то их можно иметь, как правило, в количествах, вполне достаточных для проведения очень большого числа анализов. Например, от одного такого животного, как коза или овца, можно получить более литра сыворотки, содержащей специфические антитела, которая может быть использована в разведении 1 :100 ODO. В зависимости от объема инкубационной смеси указанного количества антитела могло бы хватить для анализа 10s—2* 108 образцов, что составило бы мировой запас на многие годы. Для веществ, обладающих высокой иммуно-генной активностью, получение новой антисыворотки не составляет обычно большого труда. При работе же с веществами, обладающими слабой иммуногенностью, может возникнуть целый ряд проблем. Известны, например, случаи, когда, несмотря на активные усилия многих лабораторий, удавалось получить всего одну или две антисыворотки, обладающие приемлемыми для анализа сродством и специфичностью. Если же эти антисыворотки получают из крови, которую удалось собрать всего один раз при забое небольшого животного, то их запасы бывают крайне ограниченными, что заставляет искать другие связывающие агенты.
4.2.6. Получение антител
В табл. 4.1 приведена типичная схема иммунизации, в основе которой лежит методика, неоднократно и с успехом применявшаяся в лаборатории автора. Детали схемы выбраны
Схема иммунизации
(получение антисыворотки, специфичной по отношению к плацентарному лактогену человека)
1. Растворяют 0,6 мг очищенного ПЛЧ в 2 мл фосфатного буферного раствора (см. табл. 1.4), не содержащего никаких белков (используют стеклянные пробирки)
2. Добавляют 4,5 мл полного адъюванта Фрейнда (Difco) (см. разд. 4.2.9)
3. Тщательно гомогенизируют: обычно эту операцию проводят путем повторного набирания раствора и выталкиваиня из цельиостекляиного шприца, снабженного металлической иглой. Следует избегать контакта с пластмассами, поскольку некоторые их виды могут взаимодействовать с компонентами, входящими в состав адъювантов. Гомогенизацию можно также проводить с помощью гомогенизатора Поттера — Эльвехейма
4. Вводят по 1 мл гомогената шести крольчихам новозеландской породы. Инъекции следует делать небольшими порциями под кожу не меньше чем в шести разных точках на спине и плечах. Стричь животных для этой цели не обязательно
5. Через шесть недель повторяют инъекции, однако теперь уже каждому животному вводят не 92 мкг, а 25 мкг иммуногена
6. Еще через две недели берут для проверки 2 мл кровн, после чего проводят поддерживающую иммунизацию
7. Всего проводят четыре поддерживающие иммунизации, а затем инъекции повторяют с интервалом в 1—3 мес в зависимости от получаемых результатов и от тех требований, которые предъявляются к антисыворотке
8. Если пробный образец крови дает вполне подходящую антисыворотку, то перед каждой последующей поддерживающей иммунизацией следует собирать большее количество крови (50 мл)
