Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Последним параметром, который особенно важно знать на первых этапах налаживания метода анализа, является степень иодирования, т. е. количество атомов иода, которое приходится на одну молекулу лиганда. Определить эту величину можно исходя из удельной радиоактивности, если ее выразить в молярных единицах, имея в виду, что при 100%-ном содержании изотопа 1251 в препарате удельная радиоактивность такого препарата должна составлять приблизительно 1,8 мКи/нмоль. Допустим, например, что для иодирования 20 мкг пептидного гормона с мол. весом 20000 типа плацентарного лактогена, СТГ или пролактина человека было взято 2 мКи изотопа 1251 и выход составил 90% (90% от 2 мКи составляет
1,8 мКи, что эквивалентно 1 нмолю иода). Двадцать микрограммов гормона также составляет 1 нмоль. Таким образом, степень иодирования составляет в среднем один атом иода на одну молекулу гормона. Расчет подобного типа может оказаться полезным с практической точки зрения. При прочих равных условиях замещение одного атома в молекуле следует считать оптимальным; при более высоких степенях может меняться иммунореактивность молекулы и увеличиваться вероятности «катастрофы распада» (см. разд. 3.7.3); более низще
степени замещения нежелательны, поскольку при этом меченые молекулы лиганда будут просто разбавлены немечеными молекулами.
3.8. Альтернативные типы меток
В качестве метки может служить не только радиоактивный изотоп, но любое другое вещество, которое можно точно измерить в очень малых количествах и которое способно прочно связываться с молекулами лиганда, не вызывая заметного изменения его свойств. Ниже рассматриваются три типа неизотопных меток.
3.8.1. Флуореоцентная метка
Не очень высокая по сравнению с радиоактивным изотопом чувствительность определения флуоресцентной метки позволяет применять эту метку для анализа только тех природных соединений, которые содержатся в крови в сравнительно высоких концентрациях, таких, например, как плацентарный лактоген, хорионический гонадотропин, тироксин или кортизол; в настоящее время для количественного определения этих гормонов используют изотопные метки. К преимуществам флуоресцентной метки следует отнести возможность ее сохранения в течение длительного времени, а также отсутствие радиационного повреждения лиганда и опасности облучения. Еще одно преимущество флуоресцентной метки состоит в том, что при связывании меченого лиганда со связывающим агентом ее физические характеристики могут меняться, что позволяет измерять соотношение между свободным и связанным лигандом без их разделения. Недостатком флуоресцентных методов является высокий уровень фона, обусловленный собственной флуоресценцией большинства биологических жидкостей, который может снижать чувствительность и точность анализа.
3.8.2. Ферментные метки
Благодаря высокой каталитической активности ферментов одна молекула фермента может вызывать превращение большого числа молекул субстрата. Таким образом, по превращению субстрата можно определять содержание фермента, присутствующего в небольших количествах, используя для этой цели простой и не очень чувствительный метод, такой, как, например, колориметрия. Способность специфических ферментов связываться с другими молекулами ковалентными связями создает основу их использования для получения меченых
¦”V , ’
Глава ё
соединений. Такая возможность была практически реализована на большом числе веществ (van Weemen, Schuurs, 1971; Scharpe et al., 1976; Wisdom, 1976). Используемые в этом методе ферменты должны обладать высокой удельной активностью при значениях pH, при которых не нарушается взаимодействие антигена с антителом. К таким ферментам относятся щелочная фосфатаза, р-галактозидаза, глюкозо-6-фосфат-де-гидрогеназа, малатдегидрогеназа, пероксидаза. Для связывания ферментов с молекулами лиганда используют карбокси-диимиды, глутаровый альдегид, смешанные ангидриды и толуол-2,4-диизоцианат.
Существуют два основных типа ферментоиммунологических методов анализа, один из которых основан на связывании фермента нммуносорбентом (ELISA от англ. enzyme-linked immunosorbent assay), а другой, известный под названием метода ферментативного усиления, — на определении активности гомогенного фермента (EMIT, Syva Corporation, от англ. enzyme-multiplied immunoassay). В первом методе разделение осуществляют при помощи иммобилизованных антител. Второй метод основан на изменении активности фермента при связывании меченого лиганда с антителом, что позволяет измерять активность, не проводя разделения (Rubenstein, 1972). В одном нз вариантов этого метода (определение тироксина с использованием в качестве метки малатдегидрогеназы) активность фермента при связывании меченого лиганда с антителом повышается и само определение активности легко поддается автоматизации (Galen, Forman, 1977). Ферментная метка имеет те же достоинства, что и флуоресцентная: большой срок годности, отсутствие радиационного повреждения лиганда и опасности облучения; кроме того, при использовании ферментной метки можно ограничиться относительно простым оборудованием. Важное достоинство ферментной метки состоит также в том, что с ее помощью можно одновременно анализировать несколько различных соединений, используя в качестве меток разные ферменты. Вместе с тем для ферментной метки характерны те же недостатки, что и для флуоресцентной, а именно высокий уровень фона, обусловленный наличием в биологических жидкостях эндогенных ферментов, и недостаточная воспроизводимость, связанная с невозможностью точного определения конечной точки (Sun, Spiehler, 1976; Galen, Forman, 1977) . По этой причине ферментную метку, так же как и другие неизотопные метки, лучше всего применять для анализа веществ, присутствующих в крови в относительно больших количествах, а также в тех случаях, когда для клинических целей требуется не количественное определение ка-кого-то антигена, а ответ на вопрос об его присутствии или отсутствии («да» или «нет»), как это имеет место, например,
