Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Соль Молекулярный Концентрация
вес г/л
Фосфатный буфер, pH 7,4 358,22 14,50
Na2HP04 • 12НгО 156,03 1,48
NaH2P04 • 2HjO 121,14 6,07
Трис-буфер, pH 8,0 206,18 10,30
Трис(оксиметил)амннометаи доводят до pH
8,0 с помощью 1 М НС1 (приблизительно
29 мл)
Барбитуратный буфер, pH 7,6
Диэтилбарбитурат иатрия доводят до. pH 7,6
с помощью 1 М НС! (приблизительно 33 мл)
') Иногда случается, что рутинный и сравнительно простой метод анализа вдруг начинает давать совершенно неправильные результаты вследствие загрязнения одного из основных реагентов лигандом. Несколько кристаллов чистого вещества, попавшие в 20-лнтровую бутыль с дистиллированной водой, могут превратить ее в концентрированный растаор стандарта.
2 1 Чард
Однако при той концентрации метки, которая оказывается лимитирующей при построении кривых разведения связывающего агента, не наблюдается дальнейшего измнения и в серии калибровочных кривых. Отсюда с очевидностью следует, что добиваться повышения чувствительности за счет уменьшения концентрации метки до величины меньшей, чем 0,0125 (в модельной системе) или 8 пг (в радиоиммунологическом методе определения окситоцина), не имело бы никакого смысла.
На рис. 1.18 приведен пример практического применения модельной системы. Имея набор реагентов с неизвестными характеристиками, например окситоцин и антитела к оксито-цину, можно с помощью одной калибровочной кривой определить величину К и затем использовать эту величину в модельной системе для оценки различных концентраций реагентов. Очевидно, что получаемый результат требует экспериментальной проверки, и тем не менее такой способ имеет два преимущества: во-первых, это наиболее короткий путь, освобождающий от значительного количества проб и ошибок, и, во-вторых, зтот способ позволяет лучше понять принципы метода. Существует, однако, немало систем, в которых гетерогенность связывающего агента и трудность определения единственной величины К делают бесполезной любую попытку теоретического анализа.
Таблица 1.5
Добавки к буферам, применяемые в радиоиммунологическом методе
анализа
Добавка Источник Концентрация Цель
Белки, типа Armour Pharma 1---10 мг/мл Для стабилизации и
БСА1) ceutical Co. 0,2---1 мг/мл предотвращения по
Азид натрия Е. Lilly a. Co. 0,1 мг/мл терь, связанных с аб
Мертнолат Bayer Pharma 20 КЕ/мл2) сорбцией на поверх
Трасилол ceuticals 0,005 М ности пробирок и т. п.
Солн кальция Бактериостатик
Бактериостатик
Ингибитор ферментов,
подобных трипсину
Повышают активность
некоторых антнсыво-
роток
1) Партии очищенных белков, используемых в радиоиммунологическом методе анализа» следует проверять на присутствие в них протеолитической активности (которая может привести к протеолизу метки и соответственно к уменьшению «нулевого стаидарта>), а также на присутствие экзогенного лиганда (особенно в случае веществ» не Г обладающих видовой специфичностью, таких, например, как тироксин и кортизол). Для каждой новой партии белка следует определить величину «нулевого стандарта» н холостой пробы и сравнить их с величинами» полученными ранее для достаточно хорошей партии.
2) Единицы ингибитора калликреииа.
Главв 2
УСЛОВИЕ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА СВЯЗЫВАНИЯ— НАЛИЧИЕ ОЧИЩЕННОГО ЛИГАНДА
2.1. Требования, предъявляемые методом связывания
Для того чтобы можно было использовать метод связывания, необходимо располагать очищенным лигандом, меченым лигандом, специфическим связывающим агентом, методом разделения свободного и связанного лиганда и, наконец (в некоторых случаях), способом экстрагирования лиганда из биологических жидкостей.
2.2. Необходимость очищенного лиганда
Доступность лиганда высокой степени чистоты является обязательным условием при налаживании любого метода связывания, в связи с чем применение методов связывания ограничено кругом веществ, для которых это условие может быть выполнено. Если высокоочищенный материал легко доступен (как это имеет место, например, в случае многих стероидных гормонов, синтетических пептидных гормонов низкого молекулярного веса), он может быть использован обычным путем в качестве стандарта, для приготовления метки, для иммунизации (в случае радиоиммунологического анализа) и для учета потерь при извлечении из биологических жидкостей. Если же нужное соединение является дефицитным (например, гормоны, которые приходится выделять из биологических источников), то на некоторых стадиях анализа может быть использован относительно менее чистый материал. Однако в последнем случае приходится идти на компромисс, который допустим лишь при условии, если хотя бы один из основных реагентов является чистым.
