Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Возвращаясь к основным принципам метода, следует обратить внимание на важное значение константы, характеризующей сродство между связывающим агентом и лигандом, т. е. величины К. В конечном счете результаты анализа, получаемые методами связывания, зависят от ряда причин чисто технического характера, таких, как, например, доступность чистого лиганда, возможность получения лиганда с высокой удельной радиоактивностью или удаление неспецифических загрязнений, присутствующих в биологических жидкостях. Однако все эти причины играют второстепенную роль, а решающее значение при оценке эффективности методов связывания имеет все же энергетическая характеристика реакции, показателем которой является величина К. Поскольку вопрос
о константе равновесия неоднократно будет обсуждаться в тексте, имеет смысл рассмотреть способы определения величины К, а также некоторые теоретические вопросы, имеющие отношение к характеристике систем, используемых в методе связывания.
1.8. Измерение величины К
Для любой системы величину К можно рассчитать, исходя из калибровочной кривой, представленной в виде графика Скэтчарда. При построении графика Скэтчарда по оси ординат откладывают величину отношения между связанной меткой и свободной, а по оси абсцисс — концентрацию связанной
Ряс. 1 16. Применение графика Скэтчарда для определения величины /С. Для системы» характеризующейся одной константой равновесия (/С), получают прямую линию» наклон которой численно равен величине К» а точка пересечения с осью абсцисс отсекает от нее отрезок» равный общей концентрации связывающего агента.
фракции. Если считать, что связывающий агент является гомогенным и для иего характерно единственное значение К, то такой график будет иметь вид прямой линии. Наклон этой линии будет численно равен величине К, а точка ее пересечения с горизонтальной осью даст величину общей концентрации связывающего агента (рис. 1.16). Принцип этого взаимоотношения можно понять, исходя из уравнения (1.4).
[АгАт]
[Аг] [Ат]
¦К.
(1.4)
Для простоты обозначим равновесную концентрацию комплекса АгАт через X. Если через Аг обозначить общую концентрацию антигена в системе, а через Ат — общую концентрацию антител, то уравнение (1.4) примет следующий вид:
К.
(Аг — X) (Ат — X) *'*
Умножение обеих частей этого уравнения иа (Ат — X) дает JK-LTT = K{Ar-X) (1.10)
или
¦ К-Ат-КХ. (1.11)
(Аг - X)
При рассмотрении уравнения в этой форме можно видеть, что в левой его час-ти X эквивалентен связанной, а (Аг — X) — сво-
бодной фракции. Следовательно, величина Х/(Аг — X) представляет собой отношение между связанной и свободной фракциями. В правой части уравнения величины К и Ат являются константами, а следовательно, произведение /С*Ат тоже представляет собой постоянную величину. Переменной является величина — КХ. Таким образом, график, построенный в координатах Х/(Аг— X) (отношение связанной и свободной фракции) — X (связанная фракция), представляет собой прямую лннию с наклоном, равным —К. Это и есть график Скэтчарда.
Точка пересечения прямой с горизонтальной осью, т. е. точка, в которой отношение между связанной и свободной фракциями равно нулю, соответствует количеству Ат. Подставив это значение Х/(Аг — X) в уравнение (1.11), получим
т. е.
0 = /С * Ат-КХ, К’Ат = КХ Ат = X.
(1.12)
(1.13)
(1.14)
Хотя в принципе определение величины К представляет собой довольно простую задачу, на практике при ее решении возникает большое число проблем. Особенно это относится к антителам. За немногими исключениями антисыворотки, полученные к данному антигену, обычно содержат несколько популяций антител, имеющих различные величины К. В этих условиях график Скэтчарда представляет собой не прямую линию, а кривую, являющуюся комбинацией нескольких прямых линий, каждая из которых соответствует определенной популяции антител. Следует также учитывать, что молекулы антител двухвалентны и что связывание в одном участке молекулы может влиять на связывание в другом участке. Нельзя забывать также и тот факт, что в процессе разделения может происходить нарушение равновесия. При работе с такими природными связывающими белками, как глобулин, связывающий кортизол, возникает другая проблема, состоящая в том, что величина К меняется в зависимости от температуры, при которой проводится измерение, причем при 4°С эта величина значительно выше, чем при 37 °С. Аналогичное, но менее четко выраженное непостоянство величины К наблюдается в случае связывания антител с пептидами, тогда как при связывании антител со стероидами и другими небольшими гаптенами это изменение выражено слабо или вообще отсутствует (Keane et al., 1976). .
1.9. Система, моделирующая метод ввязывания
Для тех систем, для которых с достаточной долей достоверности может быть определена единственная величина К, было бы очень полезно знать эту величину с тем, чтобы иметь возможность предсказать поведение таких систем.при тех или иных концентрациях реагентов. Хорошим примером может служить способ подбора таких концентраций метки, при которых будет достигаться максимальная чувствительность метода -(см. разд. 8.2.1). Обычно для этой цели приходится проводить большие серии опытов, многие из которых можно было бы исключить при условии правильно сделанного теоретического прогноза.
