Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре - Бухало А.С.
ISBN 5-12-000267-6
Скачать (прямая ссылка):
‘1 ‘о
где т0 н mi - концентрации биомассы, соответствующие времени Г0 и ti — экспоненциальной фазы роста.
Экономический коэффициент (У) рассчитывали по источнику углерода на основании данных определения абсолютно сухой массы мицелия и редуцирующих вешеств в культуральной жидкости по формуле (Перт, 1978)
Y =
где X — урожай биомассы, г/л; S0 и S — начальное и конечное содержание редуцирующих веществ (РВ) в культуральной жидкости, г/л. РВ в культуральной жидкости определяли в пересчете на глюкозу без гидролиза и после 5-часового кислотного гидролиза эбулиобтатическим методом (Агеева, Корольков, 1953).
Общий азот в образцах биомассы определяли по методу Кьельдаля (Сказкин и др., 1958). При расчете сырого протеина использовали общепринятый коэффициент 6Л5. При определении а ми иного азота связанных и свободных внутриклеточных аминокислот пользовались методом Хардинга и Мак-Лина в описании Л.А.Закордонец (1982). Белок определяли после щелочного гидролиза по методу Лоури (Lowry et al., 1951).
Полный аминокислотный состав образцов биомассы поверхностного мицелия исследовали методом бумажной хроматографии (Закордонец, 1982). Связанные аминокислоты исследовали на аминокислотном анализаторе марки ”ААА-881” после удаления свободных аминокислот спиртовой экстракцией (Закордонец,
1982). Скор незаменимых аминокислот рассчитывали общепринятым методом (Химический состав ..., 1979). Содержание хитина в образцах сухой биомассы рассчитывали по разности содержания Ы-ацетил-О-глюкозамина после гидролиза НС1, используя коэффициент пересчета глюкозамина на хитине (Петрушко, Калюжный, 1971). Определение перевариваемости сырого протеина проводили по методу А.В.Хотянович и др. (1972) с молочной кислотой и пепсином.
Наличие у исследуемых штаммов высших базидиомицетов оксидаз (лакка-зы, тирозиназы, пероксидазы) устанавливали с помощью качественных цветовых химических реакций, которые проводили путем нанесения капли реактива на поверхность растущей на агаризованной среде колонии- (Stalpers, 1978). Изменение окраски отмечали через 30 мин, 3,24 и 72 ч.
1. Реакция с а-нафтолом на наличие лакказы. Кашпо спиртово-водного раствора а-нафтола (2,5 г а-нафтола, 50 мл 95 %-ного этилового спирта, 50 мл воды) наносили на растущий край колонии. При положительной реакции наблюдали фиолетовое или темно-пурпурное окрашивание мицелия.
2. Реакция с р-крезолом на наличие тирозиназы. Каплю 1 %-ного раствора р-крезола в дистиллированной воде наносили на растущий край и в центр колонии. При положительной реакции наблюдали оранжево- или красно-коричневое окрашивание мицелия.
3. Реакция с пирогаллолом и перекисью водорода. Каплю 1 %-ного раствора
пирогаллола и 0,4 %-ного раствора Н2 02, смешанных в равных количествах, наносили на край растущей колонии. При положительной реакции наблюдали оранжево-коричневое или морковно-красное окрашивание. 45
4. Реакция на наличие оксид аз по методу Бавендамма (Методы 1992). Культуру выращивали на агаризованном пивном сусле с добавлением 1 % галловой кислоты. О наличии оксидаз судили по появлению темной окраски вокруг колонии.
Протеолитическую активность определяли спектрофотометрически по методу Кунитда (Бухало на iH., 1971) при значениях pH среда 3,0 и 7,0. В качестве субстрата использовали 1 %-ный раствор казеина. Для определения пероксида зной активности культур использовали метод НМ Лидопличко с соавт. (1968).
Антибактериальную н антифунгальную активность определяли на жидких питательных средах методом серийных разведений. Действие культуральной жидкости исследуемых культур на фитопатогенные грибы устанавливали методом колодцев (Методы ..., 1982).
Изучение противоопухолевых свойств производили в опытах in vitro на тест-микробе Вас. megatherium методом витальной окраски (Айзенман и др., 1960), в реакции подавления дегидраз (Талызина, 1959). Образцы культуральных жидкостей, оказывавшие выраженное действие in vitro, испытывали в опытах на животных с перевиваемыми асцитическими опухолями. 1
2.4. Микроскопическое исследование культур
Культуры изучены в световом микроскопе "Ergaval” (ГДР) (проходящий свет, • фазовый контраст) по общепринятой методике (Методы ..., 1982). Исследовали препараты, приготовленные в воде или препаровальной смеси (вода : спирт : глицерин — 1 : 1 : 1), а также живые препараты в агаризованной среде по методу Н-М.Пидопличко (1953). Препараты зарисовывали с помощью рисовального препарата РА-4 или фотографировали, используя фотонасадку.
Культуры исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) JSM-35C (Япония) при увеличении до 20 ООО. Для исследования использовали метод Е.Квательбаума и Г.Карнера (Quattelbaum, Camer, 1980). Культуры грибов выращивали на сусло-агаровой!среде в чашках Петри. В центре чашки Петри проводили инокуляцию мицелием с агарового косяка музейной культуры. На поверхность агаризованной среды на расстоянии 3—4 см от центра чашки помещали квадратные (0,4 х 0,4 см) про стерилизованные в спирте и над пламенем горелки кусочки покровного стекла. Когда край колонии нарастал на кусочки покров-•ного стекла, их вместе с мицелием стерильным скальпелем вырезали из агаровой среды и помещали для фиксации на предметное стекло в бюкс, на дно которого была налита 1 %-ная осьмиевая кислота. Препарат культурального мицелия фиксировали в парах осьмиевой кислоты в течение 96 ч. Затем erb переносили в чашку Петри и сушили в течение 72 ч. После этого напыляли золотом в напылительной установке JII-4X с наклоном и вращением объекта, исследовали в СЭМ. При изучении Asterophora lycoperdoides и Pleurotus dryinus хламидоконидии без предварительной фиксации наносили на смазанный клеем препаровальный столик и затем напыляли золотом.
