Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии - Борисов Л.Б.
Скачать (прямая ссылка):
бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях
используют для этой цели препаровальные иглы.
Пробирку с бактериальной культурой берут в левую руку, а петлю за
петледержатель - в правую. Петлю прожигают в пламени горелки до
покраснения. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку,
прижимая ее V и IV пальцами правой руки к ладони, и обжигают край
пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю
поверхность, после чего легким скользящим движением берут материал. Затем
вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и затыкают пробкой.
После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в
пламени. Жидкий материал из пробирки или колбы можно набирать пипеткой,
удерживая ее в правой руке и закрывая отверстие II пальцем.
Приготовление препаратов для изучения микроорганизмов в живом состоянии.
Метод "висячей" капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр
которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное
стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином,
прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки.
Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В
правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над
лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют
малый сухой объектив 8, под увеличением которого
23
находят край капли, а затем устанавливают объектив 40 и исследуют
препарат.
Метод "раздавленной" капли. На поверхность обезжиренного предметного
стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и
покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей
за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40.
Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь микробов вносят в каплю 0,001%
раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят
препарат "висячая" или "раздавленная" капля и микроскопируют. После
микроскопии препараты "раздавленной" или "висячей" капли опускают в
дезинфицирующий раствор.
Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для приготовления
препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или
изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят
исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить
тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см, только при таком
распределении материала в мазке можно увидеть изолированные бактериальные
клетки. Если исследуемый материал содержится в жидкой среде, то петлей
его непосредственно наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки
высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки.
Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3
раза (в течение 3 с) через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации
погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при
дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать
деформацию клеточных структур. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и
тканей и в некоторых случаях мазки из культур микроорганизмов фиксируют
погружением на 5-20 мин в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифо->
рова, сулемовый спирт или другие фиксирующие жидкости.'
Методы окраски мазков
Простой метод. Фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним
красителем, например фуксином водным (1-2 мин) или метиленовым синим (3-5
мин), промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Сложные методы. Включают последовательное нанесение на препарат
красителей, различающихся по химическому
24
составу и цвету, протрав и дифференцирующих веществ. Это позволяет
выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды
микроорганизмов от других.
Окраска по методу Грама. 1. На фиксированный мазок наносят карболово-
спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной
бумаги. Через 1-2 мин ее снимают, а краситель сливают.
2. Наносят раствор Люголя на 1-2 мин.
3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 с до
прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
4. Промывают препарат водой.
5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1-2 мин,
промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет,
грамотрицательные - в красный (рис. 16).
Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью
удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового
фиолетового с йодом. Это зависит от различий в химическом составе и в
проницаемости клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных
бактерий, а также от соотношения РНК и ДНК в их цитоплазме. В клеточной
стенке грамположительных бактерий наиболее выражен муреиновый
(мукопептидный слой), содержащий гликопептиды и тейхоевую кислоту.
Пептидогликаны грамположительных бактерий структурно отличаются от
