Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Борисов Л.Б. -> "Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии" -> 45

Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии - Борисов Л.Б.

Борисов Л.Б. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии — М.: Медицина, 1984. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): rukovodstvoklabzadaniyampomikroekonomiki1984.djvu
Предыдущая << 1 .. 39 40 41 42 43 44 < 45 > 46 47 48 49 50 51 .. 96 >> Следующая

Иммунофлюоресцентный метод. На предметном стекле готовят мазок из
испражнений больного ко-лиэнтеритом, фиксируют на пламени и обрабатывают
иммунной сывороткой, содержащей антитела к возбудителям колиэнтерита. Для
образования комплекса антиген - антитело препарат помещают во влажную
камеру и инкубируют при 37°С в течение 15 мин, после чего тщательно
промывают изотоническим раствором хлорида натрия - удаляют несвязавшиеся
с антигеном антитела. Затем на препарат наносят флюоресцирующую
антиглобулиновую сыворотку, выдерживают в течение 15 мин при 37°С и
препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В
результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с
фиксированными на антигене специфическими антителами образуются
светящиеся комплексы антиген - антитело, которые обнаруживаются при
люминесцентной микроскопии.
Тем* 20. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ. РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА.
РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА
Для постановки реакции лизиса и реакции связывания комплемента (РСК)
используют комплемент, который содержится в сыворотке крови морских
свинок. Гемолитическая активность комплемента термолабильна и полностью
утрачивается при прогревании сыворотки в течение 30 мин при 56°С. При
адсорбции комплемента на комплексе антиген - антитело его действие
проявляется в реакции лизиса антигена, если это клетки, или не
сопровождается никакими видимыми изменениями, если это мелкодисперсные
или растворимые антигены. Для учета результатов данной реакции РСК вводят
вспомогательную (индикаторную) гемолитическую систему. Она состоит из
взвеси эритроцитов барана в изотоническом растворе хлорида натрия и
гемолитической
118
Рис. 59. Определение токсигенности коринебактерий дифтерии в реакции
преципитации в агаре.
^еыворотки кролика, полученной путем его иммунизации упомянутыми
эритроцитами.
Положительная РСК характеризуется задержкой гемолиза вследствие адсорбции
комплемента системой антиген - антитело (рис. 60). Отрицательная РСК
характеризуется наличием гемолиза, поскольку свободный комплемент
связывается с системой эритроциты барана - гемолитическая сыворотка
кролика. РСК обладает высокой чувствительностью й специфичностью, что
позволяет использовать ее для серодиагностики многих заболеваний, а также
для выявления антигенов в крови больного. Кроме того, ее применяют для
идентификации бактерий, вирусов и других антигенов.
Для постановки РСК требуется точное определение количественных
соотношений всех ингредиентов, участвующих в реакции: исследуемой
сыворотки, антигена, комплемента,
гемолитической сыворотки кролика и эритроцитов барана. Поэтому постановке
основного опыта предшествуют титрование гемолитической сыворотки и выбор
ее рабочего разведения, титрование комплемента и выбор его рабочей дозы,
титрование других ингредиентов.
Программа занятая
1. Реакция лизиса (гемолиза).
2. РСК: механизм, роль отдельных ингредиентов, техника постановки и
диагностическое применение.
Задание для выполнения лабораторной работы
1. Отметить результаты титрования комплемента и рассчитать рабочую дозу
для постановки РСК.
2. Отметить результаты титрования гемолитической сыворотки и рассчитать
рабочее разведение для приготовления гемолитической системы.
3. Поставить РСК (первую и вторую фазы) для определения присутствия
специфических антител в испытуемой сыворотке по известному антигену.
Объяснить результаты контрольных проб и необходимость их постановки,
исходя из механизма РСК.
119
jfej§ +
Исследуемая !- сыдоротка
¦Комплемент/^,
^НомШмёну//
^~у/сыБ.
Гемолитическая система
РСК
положительная
Гемолиза нет
Исследуемая увгШ + сыворотка= +
'/////л рт нет
^ РСК
отрицательная
уНотлёмШ'//',
Гемолиз
Рнс. 60. Реакция связывания комплемента (схема).
Аг - антиген; Ат - антитело; Эр - эритроциты; Тем. сыв. - гемолитическая
сыворотка.
Методические указания
Приготовление и титрование ингредиентов для РСК.
Комплемент. Для определения титра и рабочей дозы производят титрование
комплемента с помощью реакции иммунного гемолиза. Для этого свежую
сыворотку морской свинки разводят изотоническим раствором хлорида натрия
от 1: 10 до 1:40 (табл. 18). К 0,2 мл каждого разведения комплемента
добавляют по 0,4 мл гемолитической системы (смеси равных объемов 3%
суспензии эритроцитов в (изотоническом растворе хлорида натрия и
гемолитической сыворотки в разведении, соответствующем ее тройному
титру). Пробирки выдерживают при 37°С и через 30 мин определяют титр
комплемента - наибольшее разведение комплемента, которое вызывает полный
лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки. Рабочую дозу
комплемента рассчитывают, исходя из его титра. Рабочая доза комплемента
должна быть выше титра на 25%. Так, например, при титре комплемента 1 :20
в качестве рабочей дозы берут его предыдущее разведение 1:15 (см. табл.
18).
120
Таблица 18. Титрование комплемента (форма протокола)
Ингредиенты, мл JM3 пробирки
1 2 3 4 5 б 7 8
Предыдущая << 1 .. 39 40 41 42 43 44 < 45 > 46 47 48 49 50 51 .. 96 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed