Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии - Борисов Л.Б.
Скачать (прямая ссылка):
р е а к -
108
ции Кумбса'. Реакция проходит в два этапа: 1) связывание эритроцитами
(резус +) неполных антиэритроцитарных антител, содержащихся в сыворотке
крови; 2) агглютинация эритроцитов при добавлении антиглобулиновой
сыворотки в результате ее взаимодействия с фиксированными на эритроцитах
неполными антителами-иммуноглобулинами,
Задание для выполнения лабораторной работы
1. Поставить развернутую реакцию агглютинации в пробирках для определения
титра специфических антител в сыворотке, полученной от кролика на
предыдущем занятии.
2. Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с целью
идентификации изучаемых бактерий. Объяснить отрицательные результаты в
контрольных пробирках, исходя из необходимого сочетания ингредиентов,
участвующих в реакции агглютинации.
3. Отметить результаты РПГА: а) определить титр специфических антител в
сыворотке крови по результатам РПГА и б) присутствие специфического
антигена в исследуемом материале от больного по результатам РПГА.
Объяснить необходимость контролен в РПГА.
4. Отметить результаты реакции Кумбса: определить титр неполных анти-
резусных антител в сыворотке беременной женщины. Объяснить, какие
контроля должны сопровождать реакцию Кумбса.
Методические указания
Получение иммунной сыворотки. Из уха или сердца кролика на 7-й день после
окончания иммунизации берут кровь, помещают в термостат при 37°С на 10-15
мин. После свертывания крови сгусток отслаивают от стенок пробирки
стеклянной палочкой и выдерживают при 4°С в течение часа для лучшей
ретракции сгустка и более полного отделения сыворотки. Затем сыворотку
осторожно отсасывают пипеткой.
Титрование исследуемой сыворотки. Схема постановки реакции агглютинации
для определения титра антител приведена в табл. 16. Сначала готовят
основное разведение сыворотки, которое в зависимости от титра может
составлять 1:50, 1 :100 или 1:1000. Затем делают серию разведений
сыворотки путем последовательного переноса 1 мл из предыдущей пробирки в
следующую пробирку ряда. Из последней пробирки 1 мл разведенной сыворотки
удаляют для сохранения одинакового объема. В контрольную пробирку
(контроль антигена) вносят 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В
каждую пробирку с разведениями сыворотки и в контрольную пробирку вносят
пастеровской пипеткой по 2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд
микробных тел в 1 мл. Пробирки
" Антиглобулиновую сыворотку против глобулинов человека получают путем
гипернммунизации кролика человеческой сывороткой.
109
Таблица 16 Титрование исследуемой сыворотки (форма протокола)
Ингредиенты, мл Ns пробирки Контроль
1 2 3 4 5 анти- гена сыво- ротки
Изотонический раствор хлорида натрия 1 1 1 1 1 1
Исследуемая сыворотка в разведении 1 :50 1 - 1- 1 - 1 - 1 1
_ 1
Полученное разведение сыворотки Взвесь бактерий, капли 1:100 2 1:200
2 1:400 2 1:800 2 1:1600 2 2
Инкубация при 37°С в течение 2 ч с последующим выдерживанием
при ком-
иатнои температуре до следующего дня
Результаты
встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 ч, затем сутки
выдерживают при комнатной температуре. Учет реакции агглютинации
производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с
контрольных, при осторожном встряхивании.
Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: +-Н-1
полная агглютинация - хлопья агглютината в абсолютно прозрачной жидкости;
I I I неполная агглютинация - хлопья в слабоопалесцирующей жидкости; -Н-
частичная агглютинация-хлопья различимы, жидкость слегка мутная; +
слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней
плохо различимы; - отсутствие агглютинации - жидкость равномерно мутная
(рис. 51).
Реакцию учитывают как положительную при наличии отчетливой агглютинации,
выраженной не менее -Н- в опытной пробирке, и отсутствии агглютинации в
обеих контрольных пробирках. За титр сыворотки принимают последнее ее
раз-ведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее
чем ++.
Реакция агглютинации на стекле (пластинчатая реакция агглютинации).
Ставится с одним разведением диагностической агглютинирующей сыворотки,
которое в зависимости от ее титра составляет 1 :10, 1:25,1 : 50 или 1 ;
100. Предметное стекло делят восковым карандашом пополам. На одну
половину наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия, а на
другую - каплю сыворотки. Затем петлей в каждую каплю вносят небольшое
количество бактериальной культуры
но
Рис. 51. Реакция агглютинации. а - плохо выраженная; 6- хорошо
выраженная.
и перемешиают круговыми движениями в каждой капле до получения
равномерной взвеси. Стекло можно слегка подогреть, высоко держа над
пламенем горелки в течение 2-4 мин. Реакция протекает быстро. Наблюдают
за появлением зерен агглютината в каплях. Учет производят через 3-5 мин
(рис. 52).
РПГА. Реакцию используют либо для выявления специфических антител в
сыворотке больного при серодиаг: ностике, либо для идентификации
