Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии - Борисов Л.Б.
Скачать (прямая ссылка):
определяют титр лизоцима по последнему разведению, в котором наблюдается
полный лизис бактерий - просветление. Оценку активности лизоцима можно
проводить по степени мутности с использованием фотоэлектроколориметра или
по изменению оптической плотности микробной взвеси нефелометрическим
методом.
Тема 17. ОЦЕНКА ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА
ОРГАНИЗМА
Современные методы определения иммунологического статуса организма
человека включают ряд тестов для дифференцированной оценки Т- и В-систем
иммунитета. Оценка клеточного иммунитета (Т-системы) проводится путем
определения;
104
1) количества Т-лимфоцитов в крови методом спонтанного
розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами барана (Е-ро-зетки); 2)
функциональной активности Т-лимфоцитов в реакции бласттрансформации
лимфоцитов (РБТЛ) in vitro под влиянием митогенов или антигена либо по
уровню продукции лимфоцитами гуморальных медиаторов клеточного иммунитета
(лимфо-кинов) в тестах подавления миграции макрофагов и др., а также при
постановке кожных проб гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) для
оценки возможной предварительной сенсибилизации организма к данному
антигену (аллергену).
Оценка гуморального иммунитета (В-системы) проводится путем определения
количества В-лимфоцитов в крови реакцией иммунофлюоресценции с
антисывороткой против иммуноглобулинов человека или путем выявления на В-
лимфоцитах рецепторов для комплемента - с помощью теста
розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами, несущими на себе комплекс:
антиэритроцитарные антитела + комплемент (ЕАС-розет-ки). Функциональная
активность В-лимфоцитов оценивается косвенно по уровням сывороточных
иммуноглобулинов (Ig) различных классов: A,G, М.
Программа занятия
1. Методы оценки Т-системы иммунитета.
2. Методы оценки В-системы иммунитета.
3. Методы оценки специфической сенсибилизации организма.
Демонстрация
1. Результаты теста угнетения миграции макрофагов.
2. Результаты определения концентрации сывороточных иммуноглобулинов по
Манчнни.
3. Различные виды аллергенов.
Заданре для выполнения лабораторной работы
1. Произвести учет результатов метода розеткообразования лимфоцитов с
эритроцитами барана для количественной оценки содержания в крови Т-
лимфоцитов.
2. Произвести учет результатов РБТЛ для оценки функциональной активности
Т-лнмфоцитов.
3. Произвести учет результатов метода ЕАС-розсток для количественной
оценки содержания в крови В-лимфоцнтов.
4. Отметить результаты кожно-аллергической пробы, поставленной на
предварительно сенсибилизированной морской свинке.
5. Получить иммунную сыворотку крови кролика после проведенного цикла
иммунизации (титр антител определить на следующем занятии).
Методические указания
Метод розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами барана является
наиболее простым и самым распространенным
105
методом количественного учета Т-лимфоцитов периферической крови людей.
При смешивании лимфоцитов человека и эритроцитов барана последние
присоединяются избирательно только к Т-лимфоцитам, образуя так называемые
розетки. Розеткообразующей клеткой считают лимфоцит, присоединивший три
эритроцита барана и более. У здоровых людей Т-лимфоциты составляют 50-70%
от общего числа лимфоцитов.
Метод ЕАС-розеток. Один из простых методов количественного учета В-
лимфоцитов крови человека. В этом случае тест розеткообразования ставят,
как и в случае Е-розеток, но с эритроцитами барана, предварительно
инкубированными последовательно с антиэритроцитарными антителами, а затем
с комплементом. Такие эритроциты присоединяются избирательно к клеткам,
несущим рецепторы для комплемента, в том числе к В-лимфоцитам. У здоровых
людей В-лимфоциты (ЕАС-розетки) составляют 15-25% от общего числа
лимфоцитов.
РБТЛ. При культивировании лимфоцитов крови человека в присутствии
митогенов - фитогемагглютинина (ФГА) или специфического антигена - малые
лимфоциты увеличиваются в размерах и превращаются в бластные клетки,
активно синтезирующие ДНК. Этот феномен называется бластной
трансформацией лимфоцитов. Сравнение результатов производят по отношению
к лимфоцитам, культивированным в тех же условиях без стимуляторов. При
морфологическом учете РБТЛ по окончании срока культивирования делают
мазки клеток, окрашивают по Романовскому-Гимзе и подсчитывают количество
бластных форм на 100 лимфоцитов в препарате. У здоровых людей РБТЛ с ФГА
дает 60-80% бластных форм, что характеризует нормальный уровень
функциональной активности Т-лимфоцитов.
При активации лимфоцитов под влиянием митогенов или антигенов они
выделяют в среду клеточные медиаторы - л и м ф о к и н ы, по выходу
которых также можно оценивать функциональную активность Т-лимфоцитов. Из
них наиболее изучен фактор, угнетающий миграцию макрофагов. Выявляют этот
фактор в тесте угнетения миграции макрофагов. Можно, например, поместить
макрофаги (моноциты) в лунки, вырезанные в слое агарозы. За 24 ч
инкубации они образуют вокруг лунки равномерную зону миграции. В
