Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии - Борисов Л.Б.
Скачать (прямая ссылка):
пипетки выдувают в пробирку со средой. Из ткани легких готовят мазки-
отпечатки и делают посевы.
Брюшную полость вскрывают продольным разрезом брюшины ножницами, не
задевая кишечник. Осматривают органы полости,
5*
99
отмечая в протоколе наличие экссудата, величину, цвет и консистенцию
печени, селезенки, надпочечников, мезентериальных лимфатических узлов.
При необходимости делают посевы из этих органов на питательные среды. Для
приготовления мазков-отпечатков вырезают из печени, селезенки, почек
небольшие кусочки ткани, берут их пинцетом и прикасаются к предметному
стеклу поверхностью разреза. Мазки-отпечатки фиксируют в жидком фиксаторе
и окрашивают метиленовым синим. При микроскопии отмечают присутствие
микроба-возбудителя в различных органах и тканях. Результаты посевов
учитывают на следующий день после инкубации в термостате. Данные вскрытия
трупа протоколируют. Труп животного после вскрытия подлежит уничтожению.
Методы оценки вирулентности патогенных бактерий и силы токсинов
Патогенность и токсигенность являются видовыми генотипическими,
признаками микроорганизмов. Фенотипическое проявление патогенного
генотипа выражается в вирулентности (степени патогенности), а
токсигенность проявляется фенотипически в способности образовывать
токсины.
Вирулентность является штаммовым признаком, который определяется
метаболической активностью бактериальных клеток, их комдонентами и
продуктами, подавляющими защитные механизмы организма хозяина, в том
числе фагоцитоз, способствующими колонизации и распространению бактерий в
организме (инвазивность), повреждающими клетки и ткани хозяина.
К факторам, подавляющим защитные реакции организма, относятся капсульное
вещество бактерий (полисахариды или полипептиды), протеины клеточной
стенки бактерий (М-протеин стрептококка, А-протеин стафилококка), корд-
фактор микобактерий, липополисахариды энтеробактерий и др. Колонизация
(заселение) бактерий обусловлена наличием пилей (ворсинок) или свойствами
клеточной стенки, от которых зависит прилипание бактерий. Инвазивные и
повреждающие свойства бактерий связаны с образованием ферментов,
способствующих расщеплению биополимеров тканей. К таким ферментам
относятся гиалуронидаза, фибринолизин, коллагеназа, нейраминидаза, ДНК-
аза и др.
Токсигенность бактерий фенотипически проявляется в образовании белковых
токсинов, полностью или частично секрета руемых в окружающую среду.
Эндотоксины, являющиеся компонентом липополисахаридного слоя клеточной
стенки,
100
освобождаются только после разрушения клетки, обусловливая токсическое
действие на ткани макроорганизма.
Вирулентность и токсичность патогенных бактерий представляют собой
разные, но взаимосвязанные формы проявления патогенного генотипа. Они
измеряются в специальных единицах: минимальных смертельных дозах (Dosis
letalis minima) -DLM. За 1 DLM принимают наименьшую дозу возбудителя или
белкового токсина, которая вызывает гибель 95% зараженных животных. Чаще
пользуются более точной дозой; LDso, вызывающей гибель 50% зараженных
животных.
Определение ферментов, обусловливающих
инвазивность бактерий
1. Гиалуронидаза гидролизует гиалуроновую кислоту, которая перестает
давать с уксусной кислотой сгусток муцина. Для определения этого фермента
в пробирку с субстратом, содержащим гиалуроновую кислоту, вносят суточную
культуру бактерий или фильтрат бульонной культуры и инкубируют в течение
15 мин при 37°С. Затем добавляют 2-3 капли крепкой уксусной кислоты. В
пробирках, где содержится гиалуронидаза, не происходит образования
сгустка.
2. Плазмокоагулаза выявляется при посеве испытуемой культуры в 0,4 мл
стерильной цитратной плазмы крови. Посевы инкубируют при 37°С в течение
2-5 ч. В случае выработки фермента происходит свертывание плазмы, и в
контроле она остается жидкой.
3. Гемолизины определяют путем посева испытуемой культуры "бляшками" в
чашку Петри с кровяным агаром. Чашкр инкубируют в термостате при 37°С в
течение суток. В положительном случае вокруг "бляшек" образуются зоны
гемолиза.
Определение вирулентности с помощью биологических проб на лабораторных
животных
Дермонекротическая проба. Кролику внутрикожно вводят 0,2 мл бульонной
испытуемой культуры при помощи туберкулинового шприца с тонкой иглой. В
положительном случае через 2-3 сут на месте введения образуется очаг
некроза (рис. 48).
Кератоконъюнктивальная проба. Суточную агаровую культуру бактерий
стандартной петлей диаметром 5 мм вводят под нижнее веко глаза морской
свинки. Через 2-4 сут оценивается
101
выраженность керато-конъюнктивита по наличию помутнения роговицы,
нагноения и изъязвления (проба Шереня).
Определение вирулентности бактерий или силы токсина. Испытуемые препараты
в определенных дозах вводят группам лабораторных животных с последующей
регистрацией их гибели и расчетом летальных доз. Обязательным условием
при этом является строгая стандартизация: вида, пола, массы животных,
условий их содержания, полноценности питания и т.д. Ряд десятикратных
