Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии - Борисов Л.Б.
Скачать (прямая ссылка):
колоний на агаровой среде в чашках Петри.
вижности культурой протея, обработанной фенолом, ее пересевают в пробирку
с бульоном и инкубируют до следующего дня. Затем готовят препарат в
"висячей" капле и определяют подвижность. Реверсия (восстановление)
утраченного признака свидетельствует о модификационной природе
наблюдаемой изменчивости.
Постановка флюктуационного теста Лурия и Дельбрюка для выявления частоты
спонтанных мутаций, возникающих в бактериальной популяции без
предварительного воздействия какого-либо мутагена. Для определения
частоты Strr спонтанных мутантов в культуре Е. coii, чувствительной к
стрептомицину, ее засевают одновременно в одну пробирку с 10 мл
питательного бульона и в 10 пробирок с 1 мл той же среды так, чтобы в
каждой пробирке содержалось примерно 100-1000 клеток. После суточной
инкубации посевов из каждой пробы делают высевы на чашки Петри с
питательным агаром, содержащим 100 ЕД стрептомицина. Пробы из 1-й
пробирки ("общей" культуры) в объеме 0,1 мл засевают на 10 чашек, пробы
из 10 пробирок ("независимых" культур) в объеме 0,1 мл -на отдельные
чашки. Таким образом, делают посевы на 20 чашек, которые инкубируют в
течение 18-20 ч (рис. 39).
На агаровой среде могут вырасти колонии только из тех бактерий, которые
резистентны к 100 ЕД стрептомицина.
70
В том случае, если стрептомицинрезистентные бактерии образовались только
в течение суточного контакта с антибиотиком, число колоний на всех чашках
должно быть примерно одинаковым. Это свидетельствовало бы об
адаптационном механизме устойчивости к стрептомицину. Образование на
чашках различного числа колоний, выросших при высеве каждой из 10
"независимых" культур, указывает на предсуществование мутантных Strr
клеток в исследуемой популяции бактерий. Данный вывод подтверждается тем,
что мутации могут проявляться только в некоторых "независимых" культурах.
Значительные колебания (флюктуации) числа мутантных клеток в разных
"независимых" культурах обусловлены временем возникновения мутаций.
Культура, в которой мутация произошла задолго до высева на чашки, должна
содержать большое число Strr клеток и наоборот. При высевах из "общей"
культуры такие флюктуации не смогут проявиться, поскольку мутанты
независимо от момента их возникновения будут равномерно распределены по
всей популяции бульонной культуры.
Постановка опыта трансформации (рис. 40). Реципиент - штамм Вас. subtilis
Strs (сенная палочка, чувствительная к стрептомицину). Донор -ДНК,
выделенная из штамма Вас. subtilis Strr (устойчивого к стрептомицину).
Селективная среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) - питательный
агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина.
К 1 мл бульонной культуры Вас. subtilis добавляют 1 мкг/мл ДНК донора.
Смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Затем в пробирку вносят 0,1
мг/мл раствора ДНКазы в 0,5 мл хлорида магния для разрушения ДНК, не
проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма, и выдерживают в
течение 5 мин. Для определения количества образовавшихся
стрептомициноустойчивых рекомбинантов (трансформантов) 0,1 мл неразве
денной смеси (поскольку число трансформированных клеток крайне
незначительно) высевают на селективную среду в чашку Петри. Для
определения количества клеток реципиентной культуры приготовляют ее
десятикратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до 10~5
- 10-е (для получения сосчитываемого количества колоний), которые в
объеме 0,1 мл высевают на питательный агар без стрептомицина, а для
контроля -на агар со стрептомицином. На последней среде реципиентная
культура не должна расти, поскольку она чувствительна к стрептомицину.
Посевы инкубируют при 37°С. На следующий день учитывают результаты опыта
и определяют частоту трансформации по отношению коли-
71
чества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного
штамма.
Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма,
разведенного в 10-5, выросло 170 колоний, а при высеве 0,1 мл
неразведенной смеси -68 колоний рекомбинантного штамма. Поскольку каждая
колония образовалась в результате размножения только одной бактериальной
клетки, то в 0,1 мл засеянной культуры реципиента содержится 170-105
жизнеспособных клеток, а в 1 мл -170-106, или 1,7 • 108. В то же время в
0,1 мл смеси находится 68 рекомбинантных клеток, а в 1 мл -680, или 6,8 •
102. Таким образом, частота трансформации в данном опыте будет равна:
-М 1-°!!- -4,0 ID-1,7 10"
Постановка опыта специфической трансдукции (рис. 41). Реципиент - штамм
Е. coii lac", лишенный (3-галактозидазного оперона, контролирующего
ферментацию лактозы. Трансдуци-руюший фаг - фаг>.с!§а1, в геноме которого
часть генов за- , мешена Р-галактозидазным опероном Е. coii. Он является
дефектным, т. е. неспособен вызывать продуктивную инфекцию,
заканчивающуюся лизисом кишечной палочки, и обозначается буквой d (фаг X
dgal) с названием содержащегося в его геноме бактериального оперона gal.
