Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии - Борисов Л.Б.
Скачать (прямая ссылка):
эпидемиологическом анализе заболеваний; 2) фа-годифференцировки
бактериальных культур с целью установления их видовой принадлежности; 3)
фагодиагностики, заключающейся в выделении фага из организма больного
(например, из испражнений), что косвенно свидетельствует о наличии в
материале соответствующих микробов;. 4) фагопрофилактики - предупреждения
некоторых заболеваний (например, дизентерии) среди лиц, находящихся в
эпидемическом очаге; 5) фаготерапии - лечения некоторых инфекционных
заболеваний, вызванных, например, шигеллами, протеем, стафилококком,
палочкой синезеленого гноя.
Программа занятия
1. Методы выделения фага из объектов окружающей среды.
2. Методы индикации фага.
3. Методы титрования фага по Грациа.
Демонстрация
1. Методы выделения фага из объектов окружающей среды.
2. Методика обнаружения лизогенных бактерий.
Задание для выполнения лабораторной работы
По результатам поставленных опытов: а) рассчитать титр фага по методу
Грациа; б) определить спектр литического действия поливалентного фага;
в) определить фаготип стафилококковых культур, выделенных при пищевом
отравлении.
Методические указания
Выделение фага из объектов окружающей среды. Для
получения вирулентного фага готовят фильтрат исходного материала (вода,
суспензия фекалий и др.), пропуская его через бактериальные фильтры.
Фильтрат вместе с соответствующей бактериальной культурой засевают в
бульон и инкубируют при 37°С в течение 18-24 ч. После лизиса культуры
оставшиеся бактериальные клетки удаляют центрифугированием или
фильтрацией через бактериальный фильтр. Наличие фага в фильтрате
определяют качественными и количественными методами.
Качественный метод определения фагов ?. coii. Чашку Петри с питательным
агаром засевают суточной бульонной культурой кишечной палочки газоном и
подсушивают при 37°С в течение 10-15 мин. Затем на поверхность газона
наносят каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному
краю. После суточной инкубации в термостате
4-639
65
Рис. 37. Негативные колонии (стерильные пятна) бактериофагов, о - пятна
фага Та; 6 - пятна фага Ti.
просматривают чашку, отмечая наличие зоны лизиса на месте стекания капли
фага.
Количественный метод - определение титра фага по Грациа.
Для постановки опыта предварительно: а) разливают питательный агар в
чашки Петри, подсушивают в термостате; б) приготовленный полужидкий (0,7
%) питательный агар, разлитый по 3-4 мл в пробирки, растапливают в
водяной бане. Делают десятикратные разведения исследуемого фага (КГ2-
10~7, но может быть и дальше, в зависимости от предполагаемого титра) в
изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл из последнего
разведения фага (1(Г7) смешивают с таким же объемом суточной бульонной
культуры чувствительных к фагу бактерий и выливают в пробирку с
полужидким агаром, охлажденным до 45°С. Смесь быстро выливают на
поверхность агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя.
Так же готовят смесь из следующего разведения фага (1(Гв) с бактериями и
полужидким агаром и выливают на поверхность агара в другой чашке, затем -
из разведения 1(Г5. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют
при 37°С.
Незараженные фагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста
на поверхности питательного агара. Каждая инфицированная фагом бактерия
визируется и освобождает потомство фага, состоящее из сотен новых фаговых
частиц. Они внедряются в интактные клетки, и весь цикл повторяется. В
результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне появляются
"стерильные" пятна, или негативные колонии фага. Число этих пятен
соответствует
66
количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Исходя из него, можно
вычислить количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии
фага. Эта величина, характеризующая концентрацию фага, называется его
титром (табл. 5).
Определение спектра литического действия фага. Чашку с питательным агаром
делят на квадраты по числу испытуемых бактериальных культур. На каждый
квадрат петлей наносят каплю соответствующей бульонной культуры и
распределяют ее по агару в пределах данного квадрата. Затем на каждый
засеянный квадрат петлей или пастеровской пипеткой наносят по одной капле
испытуемого фага. После суточной инкубации в термостате просматривают
чашку, отмечая те квадраты, где имеется сплошной лизис бактерий или так
называемые стерильные пятна на бактериальном газоне. Количество различных
бактериальных культур, которые лизируются испытуемым фагом, определяет
широту спектра его литического действия.
Таблица 5. Результаты титрования фага по методу Грациа (форма протокола)
N' исследуемой пробы Число "стерильных" пятен фага, полученных при
посевах проб в разведениях Число фаговых частиц в 1 мл
КГ5 10'" 1СГ7
1 370 42 3 7,3 • 107
2 463 50 6 1,0 • 108
3 37 4 0 <0 О 1-
Фаготипирование бактерий. Испытуемую суточную бульонную культуру бактерий
засевают на поверхность питательного агара в чашке Петри, слегка
