Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии - Борисов Л.Б.
Скачать (прямая ссылка):
2. Методы выявления (индикации) вирусов в культуре клеток и в курином
эмбрионе.
Клеточные культуры. Культуры клеток готовят из тканей животных или
человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые),
полуперевиваемые и перевиваемые. Переви-виваемые культуры в отличие от
первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное
существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков
пассажей.
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких
последовательных этапов; измельчения ткани, разъединения клеток путем
трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных
клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной
среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с дабавлением
телячьей сыворотки крови.
Клетки эпителиальной и соединительной тканей растут в суспензии; при
оседании они довольно прочно прикрепляются
56
к стенке пробирки или флакона, по которой распространяются в виде'пласта,
состоящего из одного слоя клеток (монослоя).
Перевиваемые однослойные клеточные культуры приготовляют из
злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью
длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся
злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки
матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона
человека, почек обезьяны и др.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они
представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей
(до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток
используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают
злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
Все работы с культурами клеток требуют строжайшего соблюдения правил
асептики во избежание заноса в них различных микроорганизмов из
окружающей среды.
/После получения монослоя жизнеспособной культуры клеток, которая
начинает расти и развиваться, ее заражают материалом, содержащим
риккетсии, хламидии или вирусы. Упомянутые микроорганизмы проникают
внутрь клеток, где и размножаются:
В клетках, пораженных риккетсиями, на 3-8-й день отмечается большое
количество коккобациллярных форм, заполняющих целиком цитоплазму или ядро
клеток, которые затем гибнут.
^Хламидии также рассматривают в окрашенных по Романовскому-Гимзе
препаратах клеток^в которых наблюдают различные формы размножающихся
микроорганизмов.
чО размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по
цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено
микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.
При этом часть из них погибает и отслаивается от стенки пробирки^Вирусные
частицы, освобождающиеся при разрушении одних клеток, инфицируют другие
клетки, которые через некоторое время также погибают. В результате вместо
сплошного клеточного монослоя остаются лишь отдельные клеточные островки.
'Характер ЦПД, вызванный разными вирусами, неодинаков. При репродукции
одних (парамиксовирусы, герпесвирусы) наблюдается слияние клеток с
образованием синцития, других , (энтеровирусы, реовирусы) - сморщивание и
деструкция клеток, третьих (аденовирусы) - агрегация клеток (рис. 31, а,
б) и т. д. ЦПД вирусов оценивают в динамике, просматривая клеточную
57
Рис. 31. Культура клеток.
а - неизмененные клетки; 6 - цитопатические изменения в клетках (ЦПД).
культуру под микроскопом в разные сроки после ее заражения
вируссодержащим материалом) Некоторые вирусы (энтеровирусы, герпесвирусы)
вызывают ЦПД в течение 1-2 сут, другие - в более поздние сроки (на 4-6-й
день). Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения
(индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения
их видовой принадлежности.
|один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности
клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты - реакция
гемадсорбции (рис. 32). _ Для ее постановки в культуру клеток, зараженных
вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени
контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На
поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.
Другой метод - реакция гемагглютинации. Применяется для обнаружения
вирусов в культуральной жидкости клеточной культуры либо хорион-
аллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.
Гемагглютинацию- скучивание эритроцитов кур, гусей, морских свинок -
вызывают вирусы, содержащие в оболочке гемагглютинин/
58
Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в
культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным
разведением вируса. После 6-7-дневной инкубации их просматривают на
наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое
вызывает ЦПД в 50% зараженных культур. Титр вируса выражают количеством
цитопатических доз (ЦПД60).
