Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
Сущность каталитического действия каталазы состоит в разложении перекиси
водорода с выделением молекулярного кислорода. У грибов каталаза
встречается чаще, чем пероксидаза [356].
Фенолоксидавы мало специфичны, они катализируют в присутствии
молекулярного кислорода окисление не только разнообразных полифенолов и
их производных, но и ряда монофенолов с образованием соответствующих
хинонов. К фенолоксидазам относятся я-дифенолок-сидаза (лакказа) и о-
дифенолоксидаза (тирозиназа). Образование фе-нолоксидаз установлено для
большого ряда дереворазрушающих базидиомицетов [682].
Глюкозооксидаза осуществляет прямое окисление D-глюкозы молекулярным
кислородом с образованием глюконовой кислоты как конечного продукта. Она
широко распространена среди микромицетов.
Y.3.2. ОКСИДАЗНЫЕ ТЕСТЫ
Для определения способности грибов выделять в среду окислительные
ферменты существует несколько методов, основанных на цветных реакциях.
Эти методы разработаны для выявления оксидазной активности
дереворазрушающих базидиомицетов, однако могут быть использованы и для
других грибов.
Метод Бавендамма [510]-метод разделения грибов на целлюлозоразрушающие и
лигнинразрушающие. К агар-солодовой среде добавляют 0,2-0,5% танина или
галловой кислоты. О выделении фено-локсидаз судят на основании появления
коричневой окраски в субстрате вблизи растущего мицелия. Рекомендуют
использовать более низкие концентрации танина (0,08-0,1%), так как в
больших концентрациях он может тормозить рост гриба и влиять
непосредственно на выделение ферментов. Считают, что танин и галловая
кислота дают различный эффект и их нельзя считать физиологически
равноценными тестами [681].
Метод Йоргенсена - Вайбли основан на окислении антоцианов, изменяющих
красный или синий цвет на желтый под действием фенолок-сидаз. Рекомендуют
также смесь диэтиленпарафенилендиамина с а-наф-толом или метолом. Эту
реакцию можно использовать и для количественного определения фенолоксидаз
[640, 801].
Реакцией Бавендамма обнаруживают не менее трех ферментов: n-
дифенолоксидазу, пероксидазу и о-дифенолоксидазу. Комплексную реакцию
Бавендамма можно заменить другими цветными реакциями (табл. 11).
Ниже приведены методы определения активности пероксидазы, каталазы и
глюкозооксидазы.
176
Таблица 11. Субстратная специфичность лакказы, пероксидазы и тирозиназы
[681]
Реакция на
Субстрат Способ применения лакказу пероксидазу <н*о2)
тирозиназу
а-Нафтол 0,005 %-ный Субстрат добавляют в агар- + Синяя + Синяя
0
Гваякол солодовую сре- + Красно- + Красно- 0
0,005%-ный ДУ вато-ко- ричневая вато-ко- ричневая +
Красновато-коричневая
Тирозин 0,2 %-ный То же 0 0
Танин 0,1%- " " + Коричне- + Коричне- + Коричне-
ный 4 вая вая вая
я- Крезол 10-2 м с 0,02%-ным гликолом Заливают раствором культуру гриба
на агар-солодовой среде + Белая + Белая + Красная
Бензидин 0,1 %-ный в уксуснокислом буфере с pH 4,4 То же + Синяя +
Синяя 0
V.3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ
Первичный отбор грибов, образующих пероксидазу, проводят на специфических
субстратах их культивирования [355, 356]. Метод основан на определении
интенсивности окраски продукта окисления о-дианизидина перекисью
водорода, образованного при действии пероксидазы. Единица пероксидазы
соответствует количеству фермента, катализирующему превращение 1 мкмоля
Н202 за 1 мин в оптимальных условиях 1125].
Приборы, посуда: мерные пипетки на 1, 2,5 и 10 мл, фотоэлектроколориметр,
секундомер, термометр химический и химические пробирки на 10 мл.
Реактивы: 1) о-дианизидиновый реактив: 50 мл 0,4 М фосфатного буфера, pH
5,9; 2 мл 1%-ного спиртового раствора о-дианизидина и дистиллированной
воды до 200 мл (реактив хранят до 2 нед в посуде из темного стекла на
холоду); 2) 0,05%-ный свежеприготовленный раствор перекиси водорода; 3)
раствор фермента (культуральная жидкость или раствор препарата); 4) 50%-
ный раствор серной кислоты.
Последовательность определения. В пробирки на 10 мл приливают 0,1-0,5 мл
раствора пероксидазы, 3 мл о-дианизидинового реактива, воды до объема 4,8
мл и 0,2 мл 0,05%-ного Н202. Предварительно все растворы должны быть
нагреты до 20° С. В последнюю очередь добавляют Н202 и пробирки погружают
в водяную баню (20° С). Инкубируют 5 мин, Реакцию приостанавливают
прибавлением 50%-ной серной
177
кислоты до объема 10 мл. Интенсивность окраски измеряют на ФЭКе с зеленым
фильтром в 10-миллиметровой кювете против стандарта, который содержит все
ингредиенты, добавляемые в такой последовательности: вода, серная
кислота, фермент, Н202. Активность определяют по значению коэффициента
микромолярной экстинкции, равного 0,0128. Количество превращений Н202 за
5 мин: С = (экстинкция/0,0128) X разведение. Если инкубационная смесь
содержала 0,1 мл культуральной жидкости, экстинкция равна 0,20, то
активность пероксидазы в расчете на 1 мл культуральной жидкости будет
равна 0,20 - 10 ¦ 1/0,0128 ¦ 1000 X X 0,1 • 5 = 0,312 единицы, где 0,20 -
